培養基(ji)成纖(xian)維(wei)細(xi)胞的排除方(fang)法研(yan)究(jiu)

培養基(ji)成纖(xian)維(wei)細(xi)胞的排除方(fang)法研(yan)究(jiu)

．培養基(ji)機械刮除法(fa)：

　　是(shi)用不(bu)銹(xiu)鋼絲末(mo)端(duan)插有(you)橡(xiang)膠(jiao)刮(gua)頭(tou)（用(yong)膠塞剪成(cheng)三(san)角形插(cha)以不(bu)銹(xiu)鋼絲）、或(huo)裹(guo)少(shao)許(xu)脫脂棉(mian)制(zhi)成(cheng)，裝(zhuang)入試管(guan)中(zhong)高(gao)壓滅菌後(hou)備用（也(ye)可用(yong)特(te)制電熱(re)燒(shao)灼(zhuo)器(qi)刮(gua)除）。刮(gua)除程(cheng)序(xu)為(wei)：

　　（）標(biao)記(ji)：鏡下觀察，用(yong)不(bu)脫(tuo)色筆在培養瓶皿(min)的(de)背(bei)面圈下生長(chang)腫(zhong)瘤細(xi)胞的部(bu)位(wei)；

　　（2）刮(gua)除：棄掉培養液，把(ba)無菌膠(jiao)刮(gua)伸(shen)入瓶皿(min)中，肉(rou)眼或(huo)顯微鏡窺(kui)視下，刮除無標(biao)記(ji)空間；

　　（3）用(yong)Hanks液(ye)沖(chong)洗(xi)壹兩(liang)次，洗(xi)除被(bei)刮掉的(de)細(xi)胞；

　　（4）註入培養液繼(ji)續(xu)培養，如(ru)發(fa)現仍有(you)成纖(xian)維(wei)細(xi)胞殘留(liu)，可(ke)重(zhong)復(fu)刮(gua)除至(zhi)*除掉為(wei)止(zhi)

2．反(fan)復貼(tie)壁(bi)法(fa)：

　　根(gen)據腫(zhong)瘤細(xi)胞比成(cheng)纖(xian)維(wei)細(xi)胞培養基(ji)貼壁(bi)速(su)度(du)慢的(de)特(te)點(dian)，並結合使(shi)用不(bu)加(jia)血清的(de)營(ying)養液，把(ba)含有(you)兩(liang)類(lei)細(xi)胞的細(xi)胞懸液反(fan)復貼(tie)壁(bi)，使(shi)兩(liang)類(lei)細(xi)胞相(xiang)互(hu)分(fen)離(li)，操(cao)作方(fang)法(fa)與(yu)傳代(dai)相(xiang)同(tong)。

　　（）待(dai)細(xi)胞生長(chang)達(da)壹定(ding)數量後(hou)，倒出(chu)舊培養液，用(yong)消(xiao)化後(hou)，Hanks 沖(chong)洗(xi)2次，加入不(bu)含(han)血清的(de)培養液，吹(chui)打(da)制成(cheng)細(xi)胞懸液；

　　（2）取(qu)編號(hao)為(wei)此(ci)A、B、C三個(ge)培養瓶；首(shou)先(xian)把(ba)懸液(ye)接種(zhong)入A培養瓶中(zhong)。置(zhi)溫(wen)箱(xiang)中靜止(zhi)培養5～20分鐘(zhong)後(hou)，輕輕(qing)傾(qing)斜培養瓶，讓(rang)液體(ti)集中瓶(ping)角後(hou)慢慢吸(xi)出全(quan)部(bu)培養液，再(zai)接(jie)種入B培養瓶中(zhong)後(hou)；向A瓶(ping)中補(bu)充少(shao)許(xu)*培養液置(zhi)溫(wen)箱(xiang)中繼續培養；

　　（3）培養B瓶中(zhong)細(xi)胞5～20分鐘(zhong)後(hou)，接處(chu)理(li)A的(de)方法(fa)，把(ba)培養液註(zhu)入C培養瓶中(zhong)；再(zai)向B瓶(ping)中(zhong)補(bu)加*培養基(ji)。

　　當三個(ge)瓶(ping)內都含(han)有(you)培養液後(hou)，均(jun)在溫(wen)箱(xiang)中繼續培養。如(ru)操(cao)作成(cheng)功(gong)，次日觀察可(ke)見(jian)A瓶主(zhu)要為(wei)成(cheng)纖(xian)維(wei)細(xi)胞，B瓶兩(liang)類(lei)細(xi)胞相(xiang)雜(za)，C瓶(ping)可能主(zhu)要為(wei)癌(ai)細(xi)胞。必要時(shi)可(ke)反(fan)復處(chu)理(li)多次，直(zhi)至癌(ai)細(xi)胞純(chun)化為(wei)止(zhi)。

3．消(xiao)化排除法(fa)：

　　此法(fa)曾(zeng)用(yong)於(yu)乳癌(ai)細(xi)胞的培養，具體(ti)程序(xu)是(shi)：

　　（）先是(shi)用0.5%和0.02％EDTA（：）混(hun)合(he)液(ye)漂(piao)洗(xi)培養細(xi)胞壹次，然後(hou)再換(huan)成新(xin)的(de)混合液(ye)繼(ji)續消化，並在倒(dao)置顯微鏡下窺(kui)視和不(bu)時(shi)搖(yao)動培養瓶，到(dao)半(ban)數細(xi)胞脫落下來(lai)後(hou)，便立(li)即停(ting)止(zhi)消(xiao)化；

　　（2）把(ba)消化液吸(xi)入離(li)心(xin)管(guan)中(zhong)，離(li)心(xin)去上(shang)清(qing)，吸(xi)入另瓶(ping)中，加(jia)培養液置(zhi)溫(wen)箱(xiang)中培養；向原(yuan)瓶(ping)內也補(bu)加新(xin)的(de)培養液繼(ji)續(xu)培養。用此(ci)法(fa)處(chu)理(li)後(hou)，成纖(xian)維(wei)細(xi)胞比腫(zhong)瘤細(xi)胞易(yi)先脫(tuo)落。經(jing)過幾次反(fan)復處(chu)理(li)，可(ke)能把(ba)成纖(xian)維(wei)細(xi)胞除凈(jing)。

4．膠原(yuan)酶(mei)消(xiao)化法：

　　本法(fa)是(shi)利用(yong)成纖(xian)維(wei)細(xi)胞對(dui)膠原(yuan)酶(mei)較為(wei)敏(min)感的特(te)點(dian)，通(tong)過消化進(jin)行選擇(ze)。

　　（）可用(yong)0.5mg/ml的膠(jiao)原(yuan)酶(mei)消(xiao)化處(chu)理(li)，邊(bian)消化邊在倒(dao)置顯微鏡下窺(kui)視，當(dang)發(fa)現成纖(xian)維(wei)細(xi)胞被(bei)除掉後(hou)，即終(zhong)止(zhi)消(xiao)化；

　　（2）用Hanks洗(xi)滌(di)處(chu)理(li)壹次後(hou)，更換(huan)新(xin)培養液，繼(ji)續(xu)培養，可獲(huo)純(chun)凈(jing)腫(zhong)瘤細(xi)胞。如(ru)成(cheng)纖(xian)維(wei)細(xi)胞未(wei)被(bei)除凈(jing)，可再(zai)次重(zhong)復(fu)。

5．其它(ta)方法(fa)：

　　有(you)人發(fa)現聚丙烯(xi)酰(xian)胺(an)有(you)抑制(zhi)成(cheng)纖(xian)維(wei)細(xi)胞培養基(ji)基(ji)生長(chang)的作用(yong)；也有(you)人用(yong)聚(ju)蔗糖(tang)制(zhi)備成比重(zhong).025～.085的(de)密度梯度離(li)心(xin)液，加(jia)入細(xi)胞懸液後(hou)，在23℃中(zhong)800g離(li)心(xin)0分種(zhong)。在比重(zhong).025～.050層(ceng)為(wei)成(cheng)纖(xian)維(wei)細(xi)胞，在比重(zhong).050～.085層(ceng)為(wei)上(shang)皮(pi)細(xi)胞，再經(jing)過分離(li)進(jin)行培養。zui近(jin)也(ye)有(you)人應(ying)用(yong)特(te)殊化學物(wu)如(ru)SOD抑(yi)制(zhi)成(cheng)纖(xian)維(wei)細(xi)胞生長(chang)的方法(fa)。