快(kuai)速提(ti)取(qu)全血(xue)RNA的(de)操作步(bu)驟

快(kuai)速提(ti)取(qu)全血(xue)RNA的(de)操作步(bu)驟

操作步(bu)驟：
*次(ci)使用(yong)前請先在漂(piao)洗液(ye)RW瓶和(he)70%乙醇(chun)瓶(ping)中加入量(liang)無水(shui)乙(yi)醇(chun)!
使(shi)用(yong)前將0X紅細(xi)胞(bao)裂解液(ye)RLB用(yong)DEPC處(chu)理水稀釋到(dao)X.
操作前在裂解液(ye)RLT中加(jia)入β-巰基乙(yi)醇(chun)至(zhi)終(zhong)濃度(du)%,如 ml RLT 中加入0μl β-巰基乙(yi)醇(chun).此(ci)裂解液(ye)現用(yong)現(xian)配(pei).配(pei)好的(de)RLT 4℃可(ke)放(fang)置(zhi)壹(yi)個(ge)月.

. 在適合大(da)小的(de)RNase free離(li)心(xin)管中(zhong)加入體(ti)積（<.5 ml）加(jia)入(ru)各種(zhong)抗凝(ning)劑新鮮血(xue)液(ye) （顛倒混勻(yun)後(hou)）和3體(ti)積的(de)紅細(xi)胞(bao)裂解液(ye)RLB,顛倒混勻(yun),可輕(qing)彈(dan)管壁(bi),確(que)保混勻(yun).

2. 室溫放(fang)置0分(fen)鐘(zhong)（期間(jian)應該(gai)顛倒輕彈(dan)混勻(yun)數次(ci)幫(bang)助裂解紅細(xi)胞(bao)）.
如果RNA降解嚴重,可在冰(bing)上(shang)裂解,但是時(shi)間(jian)可長壹些以(yi)充分(fen)裂解.

3. 2,000 rpm離(li)心(xin)20秒,倒棄(qi)紅色(se)上(shang)清,並小心(xin)的(de)盡(jin)可(ke)能(neng)多(duo)的(de)吸(xi)棄(qi)上(shang)清（註意不要吸(xi)到(dao)管底(di)的(de)細(xi)胞(bao)團(tuan)）,留下(xia)完(wan)整的(de)管底(di)白(bai)細(xi)胞(bao)團(tuan). 

離(li)心(xin)後(hou)在管底(di)應該(gai)見到(dao)白(bai)色(se)的(de)白(bai)細(xi)胞(bao)團(tuan),也可(ke)能有壹些紅細(xi)胞(bao)殘片和(he)白(bai)細(xi)胞(bao)團(tuan)在壹起,但是如果看到(dao)的(de)是(shi)大(da)部(bu)分(fen)的(de)紅色(se)細(xi)胞(bao)團(tuan),說明(ming)紅細(xi)胞(bao)裂解很不充分(fen),應該(gai)再(zai)加入(ru)紅細(xi)胞(bao)裂解液(ye)重懸(xuan)細(xi)胞(bao)團(tuan)後(hou)重復(fu)步(bu)驟2,3.

上(shang)清盡可(ke)能(neng)的(de)吸(xi)棄(qi),殘留(liu)過多(duo)會稀釋裂解液(ye),造成(cheng)裂解結合異(yi)常,產量純度(du)降低(di).

4. 渦(wo)旋或(huo)者輕(qing)彈管壁(bi)將白(bai)細(xi)胞(bao)沈(chen)澱(dian)*松(song)散重(zhong)懸(xuan),加(jia)入350μl（<0.5 ml全(quan)血(xue)）或(huo)者600μl（0.5-.5ml全(quan)血(xue)）裂解液(ye)RLT,吹打(da)混(hun)勻(yun)後(hou)用(yong)手(shou)劇(ju)烈(lie)振(zhen)蕩20秒,充(chong)分(fen)裂解.病(bing)人(ren)血(xue)樣(yang)中白(bai)細(xi)胞(bao)數量可(ke)能大(da)幅增(zeng)加,應該(gai)適當減(jian)少處(chu)理量.或(huo)者按(an)照(zhao)350μl（<2x06白(bai)細(xi)胞(bao)）或(huo)者600μl（2x06-x07白(bai)細(xi)胞(bao)）比(bi)例(li)加RTL.

5. 用(yong)帶(dai)鈍(dun)針頭(tou)的(de)壹(yi)次(ci)性(xing) ml（配(pei)0.9mm針(zhen)頭） 註射器(qi)抽打(da)裂解物 5-0 次(ci)或(huo)直(zhi)到(dao)得到(dao)滿(man)意(yi)勻漿(jiang)結(jie)果（或(huo)者電(dian)動勻漿(jiang)30秒）,可(ke)以(yi)剪(jian)切(qie)DNA,降低粘稠(chou)度(du)和提(ti)高(gao)產量(liang).

6. 較(jiao)估(gu)計(ji)裂解物體(ti)積,加(jia)入(ru)等(deng)體(ti)積的(de)70%乙(yi)醇(chun)（請(qing)先檢查(zha)是否(fou)已(yi)加入無水(shui)乙(yi)醇(chun)!）,此(ci)時可能出(chu)現沈澱,但是不影響提(ti)取(qu)過程,立即吹打(da)混(hun)勻(yun),不要離(li)心(xin).

7. 立刻將混(hun)合物(wu)（每(mei)次(ci)小於700μl,多可(ke)以分(fen)兩(liang)次(ci)加入(ru)）加(jia)入(ru)壹個(ge)吸附(fu)柱RA中(zhong),（吸(xi)附柱放(fang)入(ru)收集管中(zhong)）3,000 rpm離(li)心(xin)60秒,棄(qi)掉廢液(ye).

8. 加700μl 去(qu)蛋(dan)白(bai)液(ye)RW,室溫放(fang)置30秒,2,000rpm 離(li)心(xin)30秒,棄(qi)掉廢液(ye).
如果DNA殘留(liu)明(ming)顯,可在加入RW後(hou)室溫放(fang)置5分(fen)鐘(zhong)再(zai)離(li)心(xin).

9. 加入500μl漂(piao)洗液(ye)RW（請先檢查(zha)是否(fou)已(yi)加入無水(shui)乙(yi)醇(chun)!）,2,000 rpm 離(li)心(xin)30秒,棄(qi)掉廢液(ye).加入(ru)500μl漂(piao)洗液(ye)RW,重復(fu)壹遍(bian).

0. 將(jiang)吸(xi)附(fu)柱RA放(fang)回空(kong)收集(ji)管中(zhong),3,000 rpm離(li)心(xin)2分(fen)鐘(zhong),盡量(liang)除去(qu)漂(piao)洗液(ye), 以免(mian)漂(piao)洗液(ye)中殘留(liu)乙(yi)醇(chun)抑(yi)制下遊(you)反(fan)應.

. 取(qu)出(chu)吸附柱RA,放(fang)入(ru)壹個(ge)RNase free離(li)心(xin)管中(zhong),根據預(yu)期(qi)RNA產(chan)量(liang)在吸附膜的(de)中(zhong)間(jian)部位加30-50μl RNase free water（事(shi)先在 70-80℃水浴(yu)中加(jia)熱(re)效果更好）, 室溫放(fang)置分(fen)鐘(zhong),2,000 rpm 離(li)心(xin)分(fen)鐘(zhong).

2. 如果提(ti)取(qu)全血(xue)>0.5 ml或(huo)者>2x06白(bai)細(xi)胞(bao),加(jia)30-50μl RNase free water重(zhong)復(fu)步(bu)驟,合並(bing)兩(liang)次(ci)洗脫液(ye),或(huo)者使(shi)用(yong)*次(ci)的(de)洗脫液(ye)加回到(dao)吸(xi)附(fu)柱重(zhong)復(fu)步(bu)驟壹(yi)遍(bian)（如果需要(yao)RNA濃度(du)高）.

洗脫兩(liang)遍(bian)的(de)RNA洗脫液(ye)濃度(du)高,分(fen)兩(liang)次(ci)洗脫合並(bing)洗脫液(ye)的(de)RNA產(chan)量(liang)比(bi)前者高5–30%,但是濃度(du)要低(di),用(yong)戶(hu)根(gen)據需要(yao)選(xuan)擇.