大(da)鼠(shu)內(nei)臟(zang)脂(zhi)肪素(su)Visfatin試(shi)劑(ji)盒(he)操(cao)作(zuo)步(bu)驟

大鼠(shu)內(nei)臟(zang)脂(zhi)肪素(su)Visfatin試(shi)劑(ji)盒(he)操(cao)作(zuo)步(bu)驟

本(ben)試(shi)劑(ji)僅供(gong)研(yan)究使(shi)用      標本：血清或(huo)血漿

試(shi)驗原(yuan)理(li)：
大(da)鼠(shu)內(nei)臟(zang)脂(zhi)肪素(su)Visfatin試(shi)劑(ji)盒(he)是(shi)固(gu)相夾(jia)心法(fa)酶(mei)聯免疫吸(xi)附(fu)實驗（ELISA）.已(yi)知Visfatin濃(nong)度的(de)標準(zhun)品、未(wei)知濃(nong)度的(de)樣(yang)品加(jia)入微孔酶(mei)標板內(nei)進(jin)行(xing)檢(jian)測(ce)。先(xian)將Visfatin和(he)標記的抗體(ti)同時溫育。洗(xi)滌(di)後(hou)，加(jia)入親和素(su)標記過(guo)的HRP。再(zai)經過(guo)溫育和(he)洗(xi)滌(di)，去(qu)除(chu)未(wei)結(jie)合(he)的(de)酶(mei)結(jie)合(he)物(wu)，然後加(jia)入底(di)物(wu)A、B，和(he)酶(mei)結(jie)合(he)物(wu)同時作(zuo)用(yong)。產生(sheng)顏色(se)。顏(yan)色(se)的深淺和(he)樣(yang)品中Visfatin的(de)濃(nong)度呈(cheng)比例(li)關(guan)系。

操(cao)作(zuo)註(zhu)意事項
． 試(shi)劑(ji)應(ying)按標簽說(shuo)明(ming)書(shu)儲(chu)存，使用(yong)前(qian)恢復到(dao)室(shi)溫。稀稀(xi)過(guo)後的(de)標準(zhun)品應(ying)丟(diu)棄，不可(ke)保存。
2． 實驗中(zhong)不用的(de)板(ban)條(tiao)應(ying)立即放(fang)回(hui)包裝(zhuang)袋(dai)中(zhong)，密封(feng)保存，以免變質(zhi)。
3． 不用的(de)其(qi)它試(shi)劑(ji)應(ying)包(bao)裝(zhuang)好或(huo)蓋好(hao)。不同批號的試(shi)劑(ji)不要混用。保質(zhi)前(qian)使(shi)用。
4． 使(shi)用壹次性的吸(xi)頭(tou)以免交叉汙染，吸(xi)取終止液和(he)底(di)物(wu)A、B液(ye)時(shi)，避免使用(yong)帶(dai)金(jin)屬部(bu)分的加(jia)樣(yang)器(qi)。
5． 使用(yong)幹(gan)凈的(de)塑料容器(qi)配(pei)置洗(xi)滌(di)液(ye)。使(shi)用前(qian)充分混勻(yun)試(shi)劑(ji)盒(he)裏的(de)各種成份及樣品。
6． 洗滌(di)酶(mei)標板時應(ying)充分拍幹(gan)，不要將吸(xi)水(shui)紙直(zhi)接放(fang)入酶(mei)標反應(ying)孔中吸(xi)水(shui)。
7． 底(di)物(wu)A應(ying)揮(hui)發(fa)，避(bi)免長時(shi)間(jian)打開蓋(gai)子。底(di)物(wu)B對光(guang)敏(min)感(gan)，避(bi)免長時(shi)間(jian)暴露於(yu)光(guang)下(xia)。避(bi)免用手(shou)接(jie)觸，有毒(du)。實驗完(wan)成(cheng)後(hou)應(ying)立即讀(du)取OD值(zhi)。
8． 加(jia)入試(shi)劑(ji)的順序應(ying)壹致(zhi)，以保證所(suo)有反(fan)應(ying)板(ban)孔溫育的(de)時(shi)間壹樣。
9． 按照說(shuo)明(ming)書(shu)中(zhong)標明的時間(jian)、加(jia)液(ye)的(de)量(liang)及順序進行溫育操(cao)作(zuo)。

樣(yang)品收集、處(chu)理(li)及(ji)保存方法(fa)
、 血清-----大(da)鼠內(nei)臟(zang)脂(zhi)肪素(su)Visfatin操(cao)作(zuo)過(guo)程中(zhong)避免任何(he)細(xi)胞(bao)刺(ci)激。使(shi)用(yong)不含熱(re)原(yuan)和(he)內(nei)毒(du)素的(de)試(shi)管(guan)。收集血液後，000×g離(li)心0分鐘將血清和(he)紅(hong)細(xi)胞(bao)迅速(su)小心地(di)分離(li)。
2、 血漿-----EDTA、檸檬酸(suan)鹽(yan)、肝素(su)血漿可(ke)用於(yu)檢測(ce)。000×g離(li)心30分鐘去(qu)除顆(ke)粒(li)。
3、 細胞(bao)上(shang)清液(ye)---000×g離(li)心0分鐘去(qu)除顆(ke)粒(li)和聚(ju)合(he)物(wu)。
4、 組織勻(yun)漿(jiang)-----將組(zu)織(zhi)加(jia)入適量生(sheng)理(li)鹽(yan)水(shui)搗碎(sui)。000×g離(li)心0分鐘，取(qu)上清液(ye)
5、 保存------如果(guo)樣品不立即使(shi)用(yong)，應(ying)將其(qi)分成小(xiao)部(bu)分-70 ℃保存，避免反復(fu)冷(leng)凍(dong)。盡可(ke)能的(de)不要使用(yong)溶血或高(gao)血脂(zhi)血。如果血清中(zhong)大量(liang)顆(ke)粒(li)，檢測(ce)前(qian)先(xian)離(li)心或過(guo)濾。不要在37℃或更高(gao)的(de)溫度加(jia)熱(re)解(jie)凍(dong)。應(ying)在室(shi)溫下解(jie)凍(dong)並確(que)保樣品均(jun)勻(yun)地(di)充分解凍(dong)。

2． 洗滌(di)緩(huan)沖液（50×）的(de)稀(xi)釋：蒸(zheng)餾水(shui)50倍(bei)稀(xi)釋(shi)。

操(cao)作(zuo)步(bu)驟
． 使(shi)用(yong)前(qian)，將所(suo)有試(shi)劑(ji)充分混勻(yun)。不要使液(ye)體(ti)產生(sheng)大量(liang)的(de)泡(pao)沫(mo)，以免加(jia)樣(yang)時(shi)加(jia)入大量的氣(qi)泡(pao)，產生(sheng)加(jia)樣(yang)上(shang)的(de)誤差(cha)。
2． 根據(ju)待(dai)測(ce)樣(yang)品數量(liang)加(jia)上(shang)標準(zhun)品的數(shu)量決(jue)定(ding)所(suo)需的(de)板條(tiao)數。每(mei)個標準(zhun)品和空白孔建議做(zuo)復孔。每(mei)個樣(yang)品根據(ju)自己(ji)的數(shu)量(liang)來(lai)定(ding)，能(neng)使(shi)用(yong)復孔的盡量做(zuo)復孔。標本用標本稀釋液(ye)：稀(xi)釋(shi)後加(jia)入50ul於(yu)反應(ying)孔內(nei)。
3． 加(jia)入稀釋好後(hou)的(de)標準(zhun)品50ul於(yu)反應(ying)孔、加(jia)入待(dai)測(ce)樣(yang)品50ul於(yu)反應(ying)孔內(nei)。立即加(jia)入50ul的標記的抗體(ti)。蓋上(shang)膜(mo)板，輕輕振(zhen)蕩(dang)混勻(yun)，37℃溫育小(xiao)時(shi)。
4． 甩(shuai)去孔內(nei)液(ye)體(ti)，每(mei)孔加(jia)滿(man)洗(xi)滌(di)液(ye)，振(zhen)蕩(dang)30秒，甩(shuai)去洗(xi)滌(di)液(ye)，用(yong)吸水(shui)紙拍(pai)幹(gan)。重復(fu)此操作(zuo)3次。如(ru)果(guo)用(yong)洗板機(ji)洗(xi)滌(di)，洗(xi)滌(di)次數(shu)增(zeng)加(jia)壹次。
5． 每(mei)孔加(jia)入80ul的親和鏈(lian)酶(mei)素-HRP，輕輕(qing)振蕩(dang)混勻(yun)，37℃溫育30分鐘。
6． 甩(shuai)去孔內(nei)液(ye)體(ti)，每(mei)孔加(jia)滿(man)洗(xi)滌(di)液(ye)，振(zhen)蕩(dang)30秒，甩(shuai)去洗(xi)滌(di)液(ye)，用(yong)吸水(shui)紙拍(pai)幹(gan)。重復(fu)此操作(zuo)3次。如(ru)果(guo)用(yong)洗板機(ji)洗(xi)滌(di)，洗(xi)滌(di)次數(shu)增(zeng)加(jia)壹次。
7． 每(mei)孔加(jia)入底(di)物(wu)A、B各(ge)50ul，輕(qing)輕振(zhen)蕩(dang)混勻(yun)，37℃溫育0分鐘。避(bi)免光(guang)照(zhao)。
8． 取(qu)出酶(mei)標板，迅速(su)加(jia)入50ul終止液，加(jia)入終止液後(hou)應(ying)立即測(ce)定(ding)結(jie)果(guo)。
9． 在450nm波長處(chu)測(ce)定(ding)各(ge)孔的OD值(zhi)。

大鼠(shu)內(nei)臟(zang)脂(zhi)肪素(su)Visfatin試(shi)劑(ji)盒(he)性能
. 靈(ling)敏度：zui小(xiao)的(de)檢測(ce)濃(nong)度小(xiao)於(yu)號標準(zhun)品。稀釋(shi)度的(de)線(xian)性。樣品線性回歸(gui)與(yu)預期(qi)濃(nong)度相關(guan)系數(shu)R值(zhi)為(wei)0.990。
2. 特異性：不與其(qi)它細胞(bao)因(yin)子反應(ying)。
3. 重(zhong)復(fu)性：板內(nei)、板(ban)間(jian)變(bian)異(yi)系數均(jun)小於(yu)0%。

結(jie) 果(guo) 判(pan) 斷(duan) 與 分 析
、儀(yi)器(qi)值(zhi)：於(yu)波長450nm的(de)酶(mei)標儀(yi)上(shang)讀(du)取各(ge)孔的OD值(zhi)

2、以吸(xi)光(guang)度OD值(zhi)為(wei)縱(zong)坐標（Y），相應(ying)的(de)Visfatin標準(zhun)品濃(nong)度為(wei)橫(heng)坐標（X），做(zuo)得相應(ying)的(de)曲(qu)線，樣(yang)品的Visfatin含量(liang)可(ke)根據(ju)其(qi)OD值(zhi)由標準(zhun)曲線(xian)換算(suan)出相應(ying)的(de)濃(nong)度。

3、檢(jian)測(ce)值(zhi)範圍(wei)：0-80ng/ml

4、敏(min)感度： 0. ng/ml