幹(gan)擾(rao)素檢(jian)測(ce)方(fang)法(fa)

幹擾素檢(jian)測(ce)方(fang)法(fa)

    幹(gan)擾(rao)素（IFN）是(shi)壹(yi)類具(ju)有(you)廣(guang)譜(pu)抗(kang)病(bing)毒活(huo)性(xing)的(de)蛋白質，僅(jin)在同種細胞上發揮(hui)作(zuo)用(yong)。根據其(qi)來(lai)源(yuan)、理化及生(sheng)物學(xue)性(xing)質(zhi)的(de)不同，可分(fen)為(wei)IFN-α、IFN-β、IFN-γ3種(zhong)幹(gan)擾素。其(qi)中，IFN-α主(zhu)要(yao)由白細胞產生，IFN-β由成纖(xian)維細胞產生，IFN-γ主(zhu)要(yao)由T細胞在免(mian)疫(yi)應(ying)答中受到抗(kang)原(yuan)或(huo)絲(si)裂原(yuan)活(huo)化(hua)後(hou)分(fen)泌(mi)產生(sheng)。3種(zhong)幹(gan)擾素中，IFN-α、IFN-β抗(kang)病(bing)毒作(zuo)用(yong)較強，IFN-丁(ding)免(mian)疫(yi)調(tiao)節作(zuo)用(yong)較強。目前已可(ke)用基因(yin)重組技(ji)術(shu)制備幹擾(rao)素投入(ru)臨床使用。幹(gan)擾(rao)素不能直(zhi)接(jie)滅活病(bing)毒，其(qi)抗(kang)病(bing)毒作(zuo)用(yong)是(shi)由於它能激活細胞內(nei)抗(kang)病(bing)毒蛋白基因(yin)，抗(kang)病(bing)毒蛋白，抑制病(bing)毒在(zai)體(ti)內(nei)復制(zhi)。幹(gan)擾(rao)素不僅(jin)可抑(yi)制已(yi)感染(ran)細胞內(nei)病(bing)毒的(de)復(fu)制(zhi)，而且(qie)還可(ke)使(shi)未感染(ran)細胞處於抗(kang)病(bing)毒狀態，對中斷(duan)病(bing)毒的(de)細胞間傳(chuan)播(bo)有壹(yi)定作(zuo)用(yong)；但(dan)對病(bing)毒整(zheng)合(he)基因(yin)可能僅(jin)有暫時(shi)抑(yi)制(zhi)其(qi)mRNA的(de)轉(zhuan)錄(lu)作(zuo)用(yong)，不能清除(chu)病(bing)毒基因(yin)。幹擾(rao)素的免(mian)疫(yi)調(tiao)節作(zuo)用(yong)表(biao)現(xian)為(wei)它是(shi)重要(yao)的巨(ju)噬(shi)細胞活化因(yin)子（macro-phageactivating factor，MAF），活(huo)化(hua)的(de)巨噬(shi)細胞能殺(sha)死病(bing)原(yuan)微生物(wu)或(huo)殺傷(shang)腫瘤(liu)細胞。幹擾素能增(zeng)強各(ge)種(zhong)細胞表(biao)達MAF分(fen)子(zi)從而有利(li)於遞呈(cheng)抗(kang)原(yuan)或(huo)利(li)於T細胞對靶細胞的識別和殺傷(shang)；還(hai)能促(cu)進T、B細胞的分(fen)化(hua)，活化NK細胞和中性粒細胞，從而有助(zhu)於加強免(mian)疫(yi)應(ying)答。由於幹擾(rao)素不是(shi)壹(yi)種淋巴(ba)細胞的生長(chang)因(yin)子，故常抑制(zhi)淋巴細胞（特(te)別(bie)是(shi)B細胞）的增殖。
    IFN抗(kang)病(bing)毒活(huo)性(xing)的(de)特(te)點(dian)如(ru)下(xia)：①僅(jin)僅(jin)是(shi)抑(yi)制作(zuo)用(yong)，IFN消失(shi)後病(bing)毒將(jiang)重新復(fu)制(zhi)，因(yin)此必(bi)須足量反復應(ying)用(yong)；②有相(xiang)對的種(zhong)屬(shu)特(te)異(yi)性，IFN-γ較IFN-α、IFN-β嚴(yan)格(ge)；③IFN不直接(jie)滅活病(bing)毒，而是(shi)通(tong)過細胞基因(yin)組產(chan)生(sheng)另(ling)壹(yi)些(xie)蛋白因(yin)子來(lai)發(fa)揮(hui)效能，因(yin)此不同細胞對IFN的敏(min)感(gan)性(xing)不同；④不同感染(ran)狀態的病(bing)毒-細胞系統對IFN的敏(min)感(gan)性(xing)不同，病(bing)毒大(da)量復制、引起(qi)細胞炎癥應(ying)答時(shi)，IFN易(yi)產生效應(ying)；對完整(zheng)細胞中的整(zheng)合(he)型病(bing)毒無(wu)作(zuo)用(yong)。
[檢(jian)測(ce)方(fang)法(fa)] ELISA法(fa)
[方(fang)法(fa)學(xue)原(yuan)理] 抗(kang)人(ren)IFN抗(kang)體(ti)包被(bei)在微孔反(fan)應(ying)板上，待測標本和標準(zhun)品(pin)中的IFN會與(yu)抗(kang)人(ren)IFN抗(kang)體(ti)結合，遊(you)離(li)的(de)成分(fen)被(bei)洗去，同時(shi)加入化(hua)的(de)抗(kang)人(ren)IFN抗(kang)體(ti)和辣(la)根過氧化物酶(mei)標記的親(qin)和素。與親(qin)和素特(te)異(yi)結合，抗(kang)人(ren)IFN抗(kang)體(ti)與結合在(zai)單克隆(long)抗(kang)體(ti)上的人IFN結合而形(xing)成免(mian)疫(yi)復(fu)合物(wu)，遊(you)離(li)的(de)成分(fen)被(bei)洗去。加入顯(xian)色劑，若反(fan)應(ying)孔(kong)中有IFN，HRP會使(shi)五(wu)色的顯(xian)色劑呈(cheng)現藍(lan)色，加終(zhong)止液(ye)變(bian)黃(huang)色。在波(bo)長(chang)450nm處測(ce)吸(xi)光(guang)度(du)，IFN濃度(du)與吸(xi)光(guang)度(du)成正比，可通(tong)過繪制(zhi)標準(zhun)曲線求(qiu)出(chu)標本中的IFN濃度(du)。
[標本準(zhun)備] 靜脈(mai)血(xue)2ml，不抗(kang)凝(ning)。
[試劑(ji)）
．預(yu)包被(bei)微孔反(fan)應(ying)板
2．濃(nong)縮酶結合物(wu)
3．酶(mei)結合物(wu)稀(xi)釋(shi)液(ye)
4．標準(zhun)晶和標本稀(xi)釋(shi)液(ye)
5．濃(nong)縮化抗(kang)體(ti)
6．TFN標準(zhun)品(pin)
7．濃縮洗滌液(ye)
8. 顯(xian)色劑A、B
9．終(zhong)止液(ye)
[儀(yi)器(qi)] 酶標儀(yi)或(huo)全自(zi)動(dong)酶(mei)聯(lian)免(mian)疫(yi)檢(jian)測(ce)儀(yi)。
[檢(jian)測(ce)步(bu)驟(zhou)]
．在(zai)微孔反(fan)應(ying)板相(xiang)應(ying)孔(kong)中分(fen)別(bie)加入待(dai)測(ce)樣本、不同濃度(du)標準(zhun)品(pin)00ul，再加化抗(kang)體(ti)工(gong)作(zuo)液(ye)50ul。
2．振(zhen)蕩混(hun)勻(yun)，置(zhi)20～25℃環境(jing)中溫育20min。
3．將(jiang)孔(kong)內(nei)液(ye)體(ti)吸(xi)幹，用洗滌液(ye)充(chong)分(fen)洗滌5次，幹(gan)燥。
4．除(chu)空白(bai)孔外(wai)，加入酶(mei)結合物(wu)工(gong)作(zuo)液(ye)00u。 
5．振(zhen)蕩混(hun)勻(yun)，置(zhi)20～25℃環境(jing)中溫育30min。
6．將(jiang)孔(kong)內(nei)液(ye)體(ti)吸(xi)幹，用洗滌液(ye)充(chong)分(fen)洗滌5次，幹(gan)燥。
7．每孔加入顯(xian)色劑A、B各(ge)50ul，輕(qing)輕(qing)振蕩混(hun)勻(yun)，37℃環境中避光(guang)顯(xian)色0min。
8．加入終(zhong)止液(ye)50gl後(hou)，輕(qing)輕(qing)振蕩混(hun)勻(yun)。用酶標儀(yi)（450nm波(bo)長(chang)）測定各(ge)孔(kong)吸(xi)光(guang)度(du)，與標準(zhun)曲線對照(zhao)，求出(chu)IFN值。
[正(zheng)常參考(kao)值] 各(ge)實(shi)驗室(shi)可(ke)根據檢(jian)測(ce)方(fang)法(fa)的(de)不同確立(li)正常參考(kao)值。
[註(zhu)意(yi)事(shi)項(xiang)]
．試劑(ji)盒(he)從冷(leng)藏(zang)環境中取(qu)出時(shi)應(ying)在(zai)室(shi)溫環境(jing)中平衡30min後(hou)方(fang)可使用(yong)，來(lai)用(yong)完(wan)的(de)微孔條用(yong)自封袋密(mi)封保存(cun)。
2．酶標板洗滌時(shi)各(ge)孔(kong)均需(xu)加滿(man)洗滌液(ye)，防(fang)止孔(kong)內(nei)有遊(you)離(li)酶(mei)不能洗凈(jing)。應(ying)設(she)定30-60s的(de)洗滌浸泡(pao)時(shi)間(jian)。
3.滴(di)加試劑(ji)前應(ying)將(jiang)滴(di)瓶(ping)翻(fan)轉(zhuan)數(shu)次，使(shi)液(ye)體(ti)混(hun)勻(yun)。滴(di)加時(shi)瓶(ping)身(shen)應(ying)保持垂(chui)直，以(yi)使滴(di)量準(zhun)確。
4.所(suo)有(you)樣(yang)品(pin)和廢(fei)棄物都(dou)應(ying)按(an)傳(chuan)染(ran)源(yuan)處理。終(zhong)止液(ye)為(wei)2mol／L硫(liu)酸，使用(yong)時(shi)應(ying)註(zhu)意(yi)安(an)全(quan)
5.每批樣(yang)本應(ying)同時(shi)做(zuo)標準(zhun)曲線。
6.檢(jian)測(ce)劑(ji)工(gong)作(zuo)液(ye)按(an)說明書臨用前配置(zhi)。
7.若標本OD值在(zai)標準(zhun)曲線測(ce)定範(fan)圍(wei)以外(wai)，應(ying)適(shi)當(dang)稀(xi)釋(shi)後重測。
[臨床意(yi)義] IFN水平的改變(bian)主(zhu)要(yao)見於自身(shen)免(mian)疫(yi)性(xing)疾病(bing)；在感(gan)染(ran)性(xing)疾病(bing)中，升(sheng)高見於急(ji)性病(bing)毒感(gan)染(ran)，降(jiang)低(di)見於乙(yi)型肝(gan)炎(yan)病(bing)毒攜帶者(zhe)、其(qi)他(ta)慢性病(bing)毒性(xing)肝(gan)炎(yan)及AIDS患(huan)者。