人(ren)蛋白(bai)激(ji)酶A（PKA）使(shi)用檢(jian)測(ce)說明(ming)

人蛋白(bai)激(ji)酶A（PKA）使(shi)用檢(jian)測(ce)說明(ming)

本(ben)試(shi)劑盒(he)僅(jin)供研究使(shi)用。

檢(jian)測(ce)範圍：96T
8U/L – 240U/L

使(shi)用目的(de)：本人蛋白(bai)激(ji)酶PKA試劑盒(he)用(yong)於(yu)測(ce)定(ding)人(ren)血(xue)清、血(xue)漿及(ji)相(xiang)關(guan)液(ye)體(ti)樣(yang)本(ben)中(zhong)蛋白(bai)激(ji)酶A(PKA)的活(huo)性(xing)。

實(shi)驗原理(li)
本試(shi)劑盒(he)應用雙抗(kang)體夾心法測(ce)定(ding)標(biao)本中(zhong)人蛋白(bai)激(ji)酶A(PKA)水(shui)平。用純(chun)化的人(ren)蛋白(bai)激(ji)酶A(PKA)抗體(ti)包被微(wei)孔板(ban)，制成(cheng)固(gu)相(xiang)抗(kang)體，往(wang)包被單(dan)抗的微(wei)孔(kong)中依(yi)次加入(ru)蛋白(bai)激(ji)酶A(PKA)，再與(yu)HRP標(biao)記的(de)蛋白(bai)激(ji)酶A(PKA)抗體(ti)結合，形成(cheng)抗(kang)體-抗(kang)原-酶標(biao)抗體(ti)復合物，經過*洗(xi)滌(di)後加底物(wu)TMB顯色。TMB在HRP酶的催化(hua)下(xia)轉(zhuan)化成(cheng)藍(lan)色，並(bing)在酸(suan)的作(zuo)用下轉(zhuan)化成(cheng)zui終(zhong)的黃(huang)色。顏色的(de)深(shen)淺和(he)樣(yang)品中(zhong)的(de)蛋白(bai)激(ji)酶A(PKA)呈正(zheng)相(xiang)關(guan)。用(yong)酶標(biao)儀在450nm波長(chang)下測(ce)定(ding)吸(xi)光度（OD值(zhi)），通(tong)過標(biao)準曲(qu)線計算(suan)樣(yang)品中(zhong)人(ren)蛋白(bai)激(ji)酶A(PKA)濃度。

試劑盒(he)組(zu)成(cheng) 
    30倍(bei)濃縮(suo)洗(xi)滌液(ye)    20ml×瓶(ping)    7    終(zhong)止(zhi)液    6ml×瓶(ping)
2    酶標(biao)試劑    6ml×瓶(ping)    8    標(biao)準品（480U/L）    0.5ml×瓶(ping)
3    酶標(biao)包被板(ban)    2孔×8條(tiao)    9    標(biao)準品稀釋液(ye)    .5ml×瓶(ping)
4    樣(yang)品稀釋液(ye)    6ml×瓶(ping)    0    說(shuo)明(ming)書(shu)    份(fen)
5    顯色劑A液(ye)    6ml×瓶(ping)        封(feng)板(ban)膜(mo)    2張(zhang)  
6    顯(xian)色劑B液(ye)    6ml×/瓶(ping)    2    密(mi)封袋    個(ge)

標(biao)本要(yao)求 
．標(biao)本采(cai)集後(hou)盡(jin)早進行提(ti)取(qu)，提(ti)取(qu)按(an)相(xiang)關(guan)文(wen)獻進行，提(ti)取(qu)後(hou)應盡(jin)快進行實(shi)驗。若不(bu)能(neng)馬上進行試(shi)驗，可將(jiang)標(biao)本放於(yu)-20℃保(bao)存(cun)，但(dan)應避免(mian)反復(fu)凍融(rong)
2．不(bu)能(neng)檢測(ce)含(han)NaN3的(de)樣(yang)品，因(yin)NaN3抑制辣(la)根(gen)過氧(yang)化(hua)物酶的（HRP）活(huo)性(xing)。

操(cao)作步驟(zhou)
標(biao)準品的(de)稀釋：本(ben)人(ren)蛋白(bai)激(ji)酶PKA試劑盒(he)提(ti)供(gong)原(yuan)倍(bei)標(biao)準品壹(yi)支(zhi)，用戶(hu)可按(an)照(zhao)下(xia)列圖表在小試管(guan)中(zhong)進行稀釋。
240U/L    5號(hao)標(biao)準品    50μl的(de)原(yuan)倍(bei)標(biao)準品加入(ru)50μl標(biao)準品稀釋液(ye)
20U/L    4號(hao)標(biao)準品    50μl的(de)5號(hao)標(biao)準品加入(ru)50μl標(biao)準品稀釋液(ye)
60U/L    3號(hao)標(biao)準品    50μl的(de)4號(hao)標(biao)準品加入(ru)50μl標(biao)準品稀釋液(ye)
30U/L    2號(hao)標(biao)準品    50μl的(de)3號(hao)標(biao)準品加入(ru)50μl標(biao)準品稀釋液(ye)
5U/L    號(hao)標(biao)準品    50μl的(de)2號(hao)標(biao)準品加入(ru)50μl標(biao)準品稀釋液(ye)

加樣(yang)：分(fen)別(bie)設空白(bai)孔(kong)（空白(bai)對照孔不(bu)加樣(yang)品及(ji)酶標(biao)試劑，其余各(ge)步操(cao)作相(xiang)同）、標(biao)準孔(kong)、待(dai)測(ce)樣(yang)品孔(kong)。在酶標(biao)包被板(ban)上標(biao)準品準確加樣(yang)50μl，待(dai)測(ce)樣(yang)品孔(kong)中(zhong)先加樣(yang)品稀釋液(ye)40μl，然(ran)後再(zai)加待測(ce)樣(yang)品0μl（樣(yang)品zui終(zhong)稀釋度(du)為5倍(bei)）。加樣(yang)將(jiang)樣(yang)品加於(yu)酶標(biao)板(ban)孔底部，盡(jin)量(liang)不(bu)觸(chu)及孔壁(bi)，輕(qing)輕(qing)晃(huang)動混(hun)勻(yun)。
溫育(yu)：用封(feng)板(ban)膜(mo)封(feng)板(ban)後置37℃溫育(yu)30分(fen)鐘。   
配(pei)液(ye)：將30倍(bei)濃縮(suo)洗(xi)滌液(ye)用(yong)蒸餾(liu)水(shui)30倍(bei)稀釋後(hou)備(bei)用(yong)
洗(xi)滌：小心揭(jie)掉(diao)封(feng)板(ban)膜(mo)，棄(qi)去(qu)液體(ti)，甩幹(gan)，每(mei)孔加滿洗滌液，靜(jing)置(zhi)30秒(miao)後棄(qi)去(qu)，如(ru)此重(zhong)復(fu)5次，拍幹(gan)。
加酶：每(mei)孔加入(ru)酶標(biao)試劑50μl，空(kong)白(bai)孔(kong)除(chu)外(wai)。 
溫(wen)育(yu)：操(cao)作同3。
洗滌：操(cao)作同5。
顯色：每(mei)孔先加入(ru)顯色劑A50μl，再(zai)加入(ru)顯色劑B50μl，輕(qing)輕(qing)震(zhen)蕩混(hun)勻(yun)，37℃避光顯色5分(fen)鐘.
終(zhong)止(zhi)：每(mei)孔加終止(zhi)液50μl，終(zhong)止(zhi)反應（此時(shi)藍(lan)色立轉(zhuan)黃(huang)色）。
測(ce)定(ding)：以空白(bai)空(kong)調(tiao)零，450nm波(bo)長(chang)依(yi)序(xu)測(ce)量(liang)各(ge)孔的(de)吸(xi)光度（OD值(zhi)）。 測(ce)定(ding)應在加終止(zhi)液後(hou)5分(fen)鐘以內(nei)進行。

操(cao)作程序(xu)總結：
計算(suan)
以標(biao)準物(wu)的(de)濃度為橫(heng)坐(zuo)標(biao)，OD值為縱坐(zuo)標(biao)，在坐(zuo)標(biao)紙上繪(hui)出(chu)標(biao)準曲(qu)線，根據樣(yang)品的(de)OD值(zhi)由標(biao)準曲(qu)線查出相(xiang)應的濃度；再乘以稀釋倍(bei)數；或(huo)用標(biao)準物(wu)的(de)濃度與OD值計(ji)算(suan)出標(biao)準曲(qu)線的直(zhi)線回歸(gui)方(fang)程式(shi)，將樣(yang)品的(de)OD值(zhi)代(dai)入(ru)方(fang)程式(shi)，計算(suan)出樣(yang)品濃度，再乘以稀釋倍(bei)數，即為樣(yang)品的(de)實(shi)際(ji)濃度。 

註(zhu)意事項
．人(ren)蛋白(bai)激(ji)酶PKA試劑盒(he)從(cong)冷藏環(huan)境中取(qu)出應在室(shi)溫(wen)平衡5-30分(fen)鐘後(hou)方(fang)可使(shi)用，酶標(biao)包被板(ban)開(kai)封(feng)後如(ru)未(wei)用(yong)完(wan)，板(ban)條(tiao)應裝入(ru)密(mi)封袋中(zhong)保(bao)存(cun)。
2．濃洗滌液可能(neng)會(hui)有結晶析出，稀釋時(shi)可在水(shui)浴(yu)中加溫助溶(rong)，洗(xi)滌時(shi)不(bu)影響(xiang)結果。
3．各(ge)步加樣(yang)均(jun)應使(shi)用加樣(yang)器(qi)，並(bing)經常(chang)校(xiao)對其準確性(xing)，以避免(mian)試驗誤差。壹(yi)次加樣(yang)時(shi)間(jian)控(kong)制在5分(fen)鐘內(nei)，如(ru)標(biao)本數(shu)量(liang)多(duo)，使(shi)用排(pai)槍(qiang)加樣(yang)。
4. 請每(mei)次測(ce)定(ding)的(de)同時做標(biao)準曲(qu)線，做復孔。如(ru)標(biao)本中(zhong)待測(ce)物質含(han)量(liang)過高(gao)（樣(yang)本(ben)OD值(zhi)大於(yu)標(biao)準品孔(kong)*孔(kong)的(de)OD值），請先用樣(yang)品稀釋液(ye)稀釋壹(yi)定(ding)倍(bei)數（n倍(bei)）後再(zai)測(ce)定(ding)，計(ji)算(suan)時請zui後乘以總稀釋倍(bei)數（×n×5）。
5. 封(feng)板(ban)膜(mo)只限壹(yi)次性(xing)使(shi)用，以避免(mian)交叉(cha)汙(wu)染。
6．底物(wu)請避光保(bao)存(cun)。
7．嚴格按照說(shuo)明書(shu)的操(cao)作進行，試(shi)驗結果判(pan)定(ding)必(bi)須(xu)以酶標(biao)儀讀(du)數為準.
8．所(suo)有樣(yang)品，洗(xi)滌(di)液(ye)和各(ge)種廢棄(qi)物(wu)都(dou)應按傳(chuan)染(ran)物處理(li)。
9．本試劑不(bu)同批(pi)號(hao)組分(fen)不(bu)得(de)混(hun)用。
0.如(ru)與(yu)英(ying)文(wen)說(shuo)明(ming)書(shu)有異，以英文(wen)說(shuo)明(ming)書(shu)為準。

保(bao)存(cun)條(tiao)件及(ji)有效期
．試劑盒(he)保(bao)存(cun)：；2-8℃。
2．有效期：6個(ge)月