兔(tu)血漿α顆(ke)粒膜蛋白（GMP-40）免(mian)疫(yi)分(fen)析(xi)

兔(tu)血漿α顆(ke)粒膜蛋白（GMP-40）免(mian)疫(yi)分(fen)析(xi)

實驗原理：
本(ben)試(shi)劑盒應用(yong)雙(shuang)抗(kang)體(ti)夾心法測(ce)定標(biao)本中兔(tu)血漿α顆(ke)粒膜蛋白GMP-40水(shui)平(ping)。用(yong)純化(hua)的兔(tu)血漿α顆(ke)粒膜蛋白（GMP-40）抗(kang)體(ti)包(bao)被微孔板，制(zhi)成(cheng)固(gu)相抗(kang)體，往(wang)包(bao)被單抗的微孔中依(yi)次加(jia)入(ru)血漿α顆(ke)粒膜蛋白（GMP-40），再(zai)與HRP標(biao)記(ji)的血漿α顆(ke)粒膜蛋白（GMP-40）抗(kang)體(ti)結合，形成(cheng)抗(kang)體(ti)-抗(kang)原-酶(mei)標抗(kang)體(ti)復合(he)物(wu)，經(jing)過*洗(xi)滌後(hou)加(jia)底物(wu)TMB顯色(se)。TMB在HRP酶(mei)的催(cui)化下轉化(hua)成(cheng)藍(lan)色(se)，並在酸(suan)的作用(yong)下(xia)轉化(hua)成(cheng)zui終的黃色(se)。顏色(se)的深淺(qian)和樣(yang)品中(zhong)的血漿α顆(ke)粒膜蛋白（GMP-40）呈(cheng)正(zheng)相(xiang)關(guan)。用(yong)酶(mei)標儀(yi)在(zai)450nm波(bo)長(chang)下測(ce)定吸(xi)光度（OD值），通過標準(zhun)曲線(xian)計算(suan)樣(yang)品中(zhong)兔(tu)血漿α顆(ke)粒膜蛋白（GMP-40）濃度。

註意(yi)事(shi)項：

． 試(shi)劑盒從(cong)冷(leng)藏環境中(zhong)取出應(ying)在(zai)室溫(wen)平(ping)衡(heng)5-30分(fen)鐘(zhong)後(hou)方(fang)可使用(yong)，酶(mei)標包(bao)被(bei)板開封後(hou)如(ru)未用(yong)完，板條應裝(zhuang)入(ru)密封(feng)袋中(zhong)保存。

2． 濃洗(xi)滌液(ye)可能會有(you)結晶析(xi)出，稀(xi)釋(shi)時可在水浴中加(jia)溫(wen)助(zhu)溶，洗(xi)滌時不(bu)影(ying)響(xiang)結果(guo)。

3． 各步加(jia)樣(yang)均應使用(yong)加(jia)樣(yang)器，並經(jing)常(chang)校(xiao)對(dui)其準(zhun)確性(xing)，以(yi)避(bi)免試(shi)驗誤差(cha)。壹次(ci)加(jia)樣(yang)時間(jian)控(kong)制(zhi)在5分(fen)鐘(zhong)內(nei)，如(ru)標(biao)本數(shu)量多(duo)，使(shi)用(yong)排(pai)槍加(jia)樣(yang)。

4． 請(qing)每次(ci)測(ce)定的同(tong)時做標(biao)準曲線(xian)，做(zuo)復(fu)孔。如標本中(zhong)待(dai)測(ce)物質含(han)量(liang)過高(gao)（樣(yang)本OD值大於標準(zhun)品孔*孔的OD值），請(qing)先用(yong)樣(yang)品稀(xi)釋(shi)液(ye)稀(xi)釋(shi)壹(yi)定倍(bei)數(shu)（n倍(bei)）後(hou)再(zai)測(ce)定，計算(suan)時請(qing)zui後(hou)乘以(yi)總稀(xi)釋(shi)倍(bei)數(shu)（×n×5）。

5． 封板膜只限壹次性使用(yong)，以(yi)避(bi)免交(jiao)叉汙(wu)染(ran)。

6． 底物(wu)請(qing)避光(guang)保存。

7． 嚴格(ge)按照(zhao)說明(ming)書的操作(zuo)進行(xing)，試(shi)驗結果(guo)判(pan)定必(bi)須(xu)以(yi)酶(mei)標儀(yi)讀(du)數(shu)為準(zhun).

8． 所有(you)樣(yang)品，洗(xi)滌液(ye)和(he)各種(zhong)廢(fei)棄(qi)物(wu)都應按傳(chuan)染(ran)物(wu)處(chu)理(li)。

9． 兔(tu)血漿α顆(ke)粒膜蛋白GMP-40試(shi)劑不(bu)同(tong)批(pi)號(hao)組分(fen)不(bu)得(de)混(hun)用(yong)。

0. 如(ru)與英(ying)文說明(ming)書有(you)異(yi)，以(yi)英(ying)文說明(ming)書為準(zhun)。

樣(yang)本處(chu)理(li)及(ji)要求(qiu)：

. 血清：室(shi)溫(wen)血液(ye)自然凝固(gu)0-20分(fen)鐘(zhong)，離(li)心20分(fen)鐘(zhong)左右(you)（2000-3000轉/分(fen)）。仔細(xi)收集(ji)上清(qing)，保存過程中(zhong)如(ru)出現沈(chen)澱，應(ying)再(zai)次離(li)心。

2. 血漿：應(ying)根據標本的要求(qiu)選(xuan)擇(ze)EDTA或(huo)檸(ning)檬酸鈉(na)作為抗(kang)凝劑(ji)，混(hun)合0-20分(fen)鐘(zhong)後(hou)，離(li)心20分(fen)鐘(zhong)左右(you)（2000-3000轉/分(fen)）。仔細(xi)收集(ji)上清(qing)，保存過程中(zhong)如(ru)有(you)沈(chen)澱形成(cheng)，應(ying)該(gai)再(zai)次離(li)心。

3. 尿液(ye)：用(yong)無(wu)菌管收集(ji)，離(li)心20分(fen)鐘(zhong)左右(you)（2000-3000轉/分(fen)）。仔細(xi)收集(ji)上清(qing)，保存過程中(zhong)如(ru)有(you)沈(chen)澱形成(cheng)，應(ying)再(zai)次離(li)心。胸(xiong)腹水(shui)、腦脊液(ye)參(can)照(zhao)實行(xing)。

4. 細(xi)胞培養(yang)上清(qing)：檢(jian)測(ce)分(fen)泌(mi)性(xing)的成(cheng)份時，用(yong)無(wu)菌管收集(ji)。離(li)心20分(fen)鐘(zhong)左右(you)（2000-3000轉/分(fen)）。仔細(xi)收集(ji)上清(qing)。檢(jian)測(ce)細(xi)胞內(nei)的成(cheng)份時，用(yong)PBS（PH7.2-7.4）稀(xi)釋(shi)細(xi)胞懸(xuan)液(ye)，細(xi)胞濃度達到(dao)00萬(wan)/ml左右(you)。通(tong)過反(fan)復(fu)凍(dong)融，以(yi)使(shi)細(xi)胞破(po)壞並放出細(xi)胞內(nei)成(cheng)份。離(li)心20分(fen)鐘(zhong)左右(you)（2000-3000轉/分(fen)）。仔細(xi)收集(ji)上清(qing)。保存過程中(zhong)如(ru)有(you)沈(chen)澱形成(cheng)，應(ying)再(zai)次離(li)心。

5. 組(zu)織標(biao)本：切割(ge)標(biao)本後(hou)，稱(cheng)取重(zhong)量。加(jia)入(ru)壹定量(liang)的PBS，PH7.4。用(yong)液(ye)氮(dan)迅(xun)速(su)冷(leng)凍保存備用(yong)。標(biao)本融化後(hou)仍(reng)然保持(chi)2-8℃的溫(wen)度。加(jia)入(ru)壹定量(liang)的PBS（PH7.4），用(yong)手(shou)工或勻(yun)漿(jiang)器將標本勻漿充(chong)分(fen)。離(li)心20分(fen)鐘(zhong)左右(you)（2000-3000轉/分(fen)）。仔細(xi)收集(ji)上清(qing)。分(fen)裝後(hou)壹(yi)份待(dai)檢(jian)測(ce)，其余(yu)冷(leng)凍備(bei)用(yong)。

6. 標(biao)本采集(ji)後(hou)盡早(zao)進(jin)行(xing)提取，提取按相(xiang)關(guan)文(wen)獻進(jin)行(xing)，提取後(hou)應(ying)盡快(kuai)進行(xing)實驗。若不(bu)能(neng)馬(ma)上進(jin)行(xing)試(shi)驗，可將標本放於-20℃保存，但(dan)應避(bi)免(mian)反(fan)復(fu)凍(dong)融.

7. 不(bu)能(neng)檢(jian)測(ce)含NaN3的樣(yang)品，因(yin)NaN3抑(yi)制(zhi)辣根過氧化(hua)物酶(mei)的（HRP）活性(xing)。

操作步驟

.標(biao)準品的稀(xi)釋(shi)與(yu)加(jia)樣(yang)：在酶(mei)標包(bao)被(bei)板上設(she)標準(zhun)品孔0孔，在*、第二孔中分(fen)別加(jia)標準(zhun)品00μl，然(ran)後(hou)在(zai)*、第二孔中加(jia)標準(zhun)品稀(xi)釋(shi)液(ye)50μl，混(hun)勻；然(ran)後(hou)從(cong)*孔、第二孔中各取(qu)00μl分(fen)別加(jia)到第(di)三(san)孔和第四(si)孔，再(zai)在第(di)三(san)、第(di)四(si)孔分(fen)別加(jia)標準(zhun)品稀(xi)釋(shi)液(ye)50μl，混(hun)勻；然(ran)後(hou)在(zai)第三(san)孔和第四(si)孔中先各取(qu)50μl棄(qi)掉(diao)，再(zai)各取(qu)50μl分(fen)別加(jia)到第(di)五、第六(liu)孔中，再(zai)在第(di)五、第六(liu)孔中分(fen)別加(jia)標準(zhun)品稀(xi)釋(shi)液(ye)50ul，混(hun)勻；混(hun)勻後(hou)從(cong)第(di)五、第六(liu)孔中各取(qu)50μl分(fen)別加(jia)到第(di)七、第(di)八孔中，再(zai)在第(di)七、第(di)八孔中分(fen)別加(jia)標準(zhun)品稀(xi)釋(shi)液(ye)50μl，混(hun)勻後(hou)從(cong)第(di)七、第(di)八孔中分(fen)別取(qu)50μl加(jia)到第(di)九、第十(shi)孔中，再(zai)在第(di)九第十(shi)孔分(fen)別加(jia)標準(zhun)品稀(xi)釋(shi)液(ye)50μl，混(hun)勻後(hou)從(cong)第(di)九第十(shi)孔中各取(qu)50μl棄(qi)掉(diao)。（稀(xi)釋(shi)後(hou)各孔加(jia)樣(yang)量都為50μl，濃度分(fen)別為800ng/L，200ng/L ，600ng/L，300ng/L， 50ng/L）。

2.加(jia)樣(yang)：分(fen)別設(she)空(kong)白孔（空(kong)白對(dui)照孔不(bu)加(jia)樣(yang)品及(ji)酶(mei)標試(shi)劑，其(qi)余各步操作(zuo)相同(tong)）、待(dai)測(ce)樣(yang)品孔。在酶(mei)標包(bao)被(bei)板上待(dai)測(ce)樣(yang)品孔中先加(jia)樣(yang)品稀(xi)釋(shi)液(ye)40μl，然(ran)後(hou)再(zai)加(jia)待測(ce)樣(yang)品0μl（樣(yang)品zui終稀(xi)釋(shi)度為5倍(bei)）。加(jia)樣(yang)將樣(yang)品加(jia)於酶(mei)標板孔底部(bu)，盡量(liang)不(bu)觸(chu)及孔壁，輕輕晃動混(hun)勻。

3.溫(wen)育(yu)：用(yong)封(feng)板膜封板後(hou)置(zhi)37℃溫(wen)育(yu)30分(fen)鐘(zhong)。

4.配(pei)液(ye)：將(jiang)30（48T的20倍(bei)）倍(bei)濃縮(suo)洗(xi)滌液(ye)用(yong)蒸(zheng)餾水30（48T的20倍(bei)）倍(bei)稀(xi)釋(shi)後(hou)備(bei)用(yong)。

5.洗(xi)滌：小(xiao)心揭(jie)掉封(feng)板膜，棄(qi)去(qu)液(ye)體(ti)，甩(shuai)幹，每孔加(jia)滿洗(xi)滌液(ye)，靜(jing)置(zhi)30秒後(hou)棄(qi)去(qu)，如(ru)此重復5次(ci)，拍(pai)幹。

6.加(jia)酶(mei)：每孔加(jia)入(ru)酶(mei)標試(shi)劑50μl，空(kong)白孔除外。

7.溫(wen)育(yu)：操(cao)作同(tong)3。

8.洗(xi)滌：操(cao)作同(tong)5。

9.顯(xian)色(se)：每孔先加(jia)入(ru)顯色(se)劑A50μl，再(zai)加(jia)入(ru)顯色(se)劑B50μl，輕輕震蕩混(hun)勻，37℃避(bi)光顯色(se)5分(fen)鐘(zhong).

0.終止(zhi)：每(mei)孔加(jia)終止(zhi)液(ye)50μl，終止(zhi)反(fan)應(ying)（此時藍(lan)色(se)立轉黃色(se)）。

.測(ce)定：以(yi)空(kong)白空(kong)調零，450nm波(bo)長(chang)依(yi)序(xu)測(ce)量各孔的吸(xi)光度（OD值）。 測(ce)定應(ying)在加(jia)終止(zhi)液(ye)後(hou)5分(fen)鐘(zhong)以(yi)內(nei)進行(xing)。

計算(suan)：
兔(tu)血漿α顆(ke)粒膜蛋白GMP-40以(yi)標(biao)準物(wu)的濃度為橫坐(zuo)標(biao)，OD值為縱(zong)坐(zuo)標(biao)，在(zai)坐(zuo)標(biao)紙(zhi)上繪(hui)出標(biao)準曲線(xian)，根據樣(yang)品的OD值由標準曲線(xian)查出相(xiang)應的濃度；再(zai)乘以(yi)稀(xi)釋(shi)倍(bei)數(shu)；或用(yong)標(biao)準物的濃度與OD值計算(suan)出(chu)標準曲線(xian)的直(zhi)線(xian)回歸方程(cheng)式，將(jiang)樣(yang)品的OD值代入(ru)方程(cheng)式，計算(suan)出(chu)樣(yang)品濃度，再(zai)乘以(yi)稀(xi)釋(shi)倍(bei)數(shu)，即為樣(yang)品的實際濃度。