兔(tu)子膠原(yuan)酶(mei)I（Collagenase I）操(cao)作(zuo)步(bu)驟

兔(tu)子膠原(yuan)酶(mei)I（Collagenase I）操(cao)作(zuo)步(bu)驟

實驗(yan)原(yuan)理(li)：
本(ben)試(shi)劑盒應(ying)用雙(shuang)抗體夾(jia)心法(fa)測定(ding)標(biao)本(ben)中兔(tu)子膠原(yuan)酶(mei)Collagenase I水(shui)平。用純化的(de)兔(tu)子膠原(yuan)酶(mei)I（Collagenase I）抗體包(bao)被(bei)微孔板，制成固(gu)相抗體，往包被(bei)單抗的(de)微(wei)孔中依次加(jia)入(ru)膠原(yuan)酶(mei)I（Collagenase I），再(zai)與(yu)HRP標記(ji)的(de)膠原(yuan)酶(mei)I（Collagenase I）抗體結合，形(xing)成抗體-抗原(yuan)-酶(mei)標(biao)抗體復合物(wu)，經(jing)過(guo)*洗滌後加底(di)物(wu)TMB顯(xian)色(se)。TMB在(zai)HRP酶(mei)的(de)催化(hua)下(xia)轉化成(cheng)藍(lan)色(se)，並(bing)在(zai)酸(suan)的(de)作(zuo)用下(xia)轉化成(cheng)zui終的(de)黃色(se)。顏(yan)色(se)的(de)深(shen)淺(qian)和(he)樣(yang)品(pin)中(zhong)的(de)膠原(yuan)酶(mei)I（Collagenase I）呈(cheng)正(zheng)相關。用酶標(biao)儀(yi)在(zai)450nm波(bo)長(chang)下(xia)測(ce)定吸光度(du)（OD值），通過(guo)標準曲線計算樣(yang)品(pin)中(zhong)兔(tu)子膠原(yuan)酶(mei)I（Collagenase I）濃(nong)度(du)。

註(zhu)意(yi)事項：

．  試(shi)劑盒從冷(leng)藏(zang)環境(jing)中取(qu)出(chu)應(ying)在(zai)室(shi)溫(wen)平衡(heng)5-30分(fen)鐘後方(fang)可(ke)使用，酶標(biao)包(bao)被(bei)板開封後如未(wei)用完，板條應(ying)裝入(ru)密(mi)封袋中(zhong)保存(cun)。

2．  濃(nong)洗(xi)滌液可能(neng)會有(you)結晶(jing)析(xi)出(chu)，稀(xi)釋(shi)時(shi)可在(zai)水(shui)浴中加(jia)溫(wen)助溶，洗(xi)滌時(shi)不(bu)影(ying)響結果(guo)。

3．  各(ge)步(bu)加(jia)樣(yang)均(jun)應(ying)使用加樣(yang)器，並(bing)經常(chang)校(xiao)對(dui)其(qi)準(zhun)確(que)性(xing)，以避免試(shi)驗誤差。壹(yi)次(ci)加樣(yang)時(shi)間控(kong)制在(zai)5分(fen)鐘內，如(ru)標(biao)本(ben)數(shu)量多(duo)，使用排(pai)槍(qiang)加樣(yang)。

4．  請(qing)每次測定(ding)的(de)同(tong)時(shi)做(zuo)標準(zhun)曲(qu)線，做(zuo)復孔。如標本(ben)中待(dai)測(ce)物(wu)質(zhi)含(han)量過(guo)高（樣(yang)本(ben)OD值大於(yu)標(biao)準(zhun)品(pin)孔*孔的(de)OD值），請先(xian)用樣(yang)品(pin)稀(xi)釋(shi)液稀(xi)釋(shi)壹(yi)定(ding)倍數(shu)（n倍）後再(zai)測(ce)定(ding)，計算時(shi)請zui後乘以(yi)總稀釋倍數(shu)（×n×5）。

5．  封板膜(mo)只限(xian)壹(yi)次(ci)性(xing)使用，以避免交叉(cha)汙(wu)染。

6．  底物(wu)請(qing)避光保存。

7．  嚴(yan)格按照說(shuo)明(ming)書(shu)的(de)操(cao)作(zuo)進行，試(shi)驗結果(guo)判(pan)定(ding)必(bi)須以(yi)酶標(biao)儀(yi)讀(du)數(shu)為準.

8．  所有(you)樣(yang)品(pin)，洗(xi)滌液和各(ge)種廢棄(qi)物(wu)都(dou)應(ying)按傳(chuan)染物(wu)處理。

9．  本(ben)試(shi)劑不(bu)同(tong)批(pi)號組(zu)分不(bu)得(de)混用。

0. 如與(yu)英文(wen)說明(ming)書(shu)有(you)異，以英文(wen)說明(ming)書(shu)為準。

操作(zuo)步(bu)驟

.        標(biao)準品(pin)的(de)稀(xi)釋(shi)與(yu)加樣(yang)：兔(tu)子膠原(yuan)酶(mei)Collagenase I在(zai)酶(mei)標(biao)包(bao)被(bei)板上設(she)標準(zhun)品(pin)孔0孔，在(zai)*、第(di)二(er)孔中分別加標(biao)準品(pin)00μl，然後在(zai)*、第(di)二(er)孔中加標(biao)準品(pin)稀(xi)釋(shi)液50μl，混勻；然後從*孔、第二(er)孔中各取(qu)00μl分別加到第(di)三(san)孔和第四(si)孔，再(zai)在(zai)第(di)三(san)、第(di)四孔分別加標(biao)準品(pin)稀(xi)釋(shi)液50μl，混勻；然後在(zai)第(di)三(san)孔和第四(si)孔中先(xian)各(ge)取50μl棄(qi)掉(diao)，再(zai)各(ge)取(qu)50μl分(fen)別加到第(di)五(wu)、第(di)六孔中，再(zai)在(zai)第(di)五(wu)、第(di)六孔中分別加標(biao)準品(pin)稀(xi)釋(shi)液50ul，混勻；混勻後從第五(wu)、第(di)六孔中各取(qu)50μl分別加到第(di)七(qi)、第八(ba)孔中，再(zai)在(zai)第(di)七(qi)、第(di)八(ba)孔中分別加標(biao)準品(pin)稀(xi)釋(shi)液50μl，混勻後從第七、第八(ba)孔中分別取50μl加(jia)到第(di)九(jiu)、第十孔中，再(zai)在(zai)第(di)九(jiu)第(di)十孔分別加標(biao)準品(pin)稀(xi)釋(shi)液50μl，混勻後從第九第十孔中各取(qu)50μl棄(qi)掉(diao)。（稀(xi)釋(shi)後各孔加樣(yang)量都(dou)為50μl，濃(nong)度(du)分(fen)別為800ng/L，200ng/L ，600ng/L，300ng/L， 50ng/L）。

2.         加樣(yang)：分(fen)別設(she)空白(bai)孔（空白(bai)對照(zhao)孔不(bu)加(jia)樣(yang)品(pin)及酶標試(shi)劑，其(qi)余各(ge)步(bu)操(cao)作(zuo)相同(tong)）、待(dai)測樣(yang)品(pin)孔。在(zai)酶(mei)標(biao)包(bao)被(bei)板上待測(ce)樣(yang)品(pin)孔中先(xian)加(jia)樣(yang)品(pin)稀(xi)釋(shi)液40μl，然後再(zai)加(jia)待(dai)測(ce)樣(yang)品(pin)0μl（樣(yang)品(pin)zui終(zhong)稀(xi)釋度(du)為5倍）。加樣(yang)將(jiang)樣(yang)品(pin)加(jia)於(yu)酶(mei)標(biao)板孔底部，盡(jin)量不(bu)觸(chu)及孔壁(bi)，輕(qing)輕(qing)晃動混勻。

3.         溫(wen)育：用封板膜(mo)封板後置37℃溫(wen)育30分鐘。

4.         配(pei)液：將30（48T的(de)20倍(bei)）倍(bei)濃(nong)縮(suo)洗(xi)滌液用蒸(zheng)餾水(shui)30（48T的(de)20倍(bei)）倍(bei)稀釋後備用。

5.         洗滌：小心揭(jie)掉(diao)封板膜(mo)，棄(qi)去液(ye)體，甩幹，每孔加滿洗(xi)滌液，靜置30秒(miao)後棄(qi)去，如(ru)此重(zhong)復5次，拍(pai)幹。

6.         加(jia)酶(mei)：每(mei)孔加入(ru)酶標(biao)試(shi)劑50μl，空(kong)白(bai)孔除外。

7.         溫(wen)育：操作(zuo)同(tong)3。

8.         洗(xi)滌：操作(zuo)同(tong)5。

9.         顯(xian)色(se)：每(mei)孔先(xian)加(jia)入(ru)顯(xian)色(se)劑(ji)A50μl，再(zai)加(jia)入(ru)顯(xian)色(se)劑(ji)B50μl，輕(qing)輕(qing)震蕩混勻，37℃避光顯(xian)色(se)5分(fen)鐘.

0.     終(zhong)止：每孔加終止(zhi)液50μl，終止反應(ying)（此時(shi)藍(lan)色(se)立(li)轉黃色(se)）。

.     測(ce)定：以空白(bai)空調(tiao)零，450nm波(bo)長依序測(ce)量各孔的(de)吸(xi)光(guang)度（OD值）。 測定(ding)應(ying)在(zai)加(jia)終(zhong)止(zhi)液後5分鐘以(yi)內進(jin)行。

樣(yang)本(ben)處理及要求(qiu)：

. 血清(qing)：室(shi)溫(wen)血液(ye)自然凝固(gu)0-20分(fen)鐘，離(li)心20分鐘左(zuo)右（2000-3000轉/分）。仔(zai)細收集(ji)上(shang)清，保存(cun)過(guo)程中(zhong)如(ru)出(chu)現沈(chen)澱(dian)，應(ying)再(zai)次(ci)離(li)心。

2. 血漿：應(ying)根據(ju)標(biao)本(ben)的(de)要(yao)求(qiu)選擇EDTA或檸(ning)檬(meng)酸(suan)鈉(na)作(zuo)為抗凝劑(ji)，混合0-20分(fen)鐘後，離心20分鐘左(zuo)右（2000-3000轉/分）。仔(zai)細收集(ji)上(shang)清，保存(cun)過(guo)程中(zhong)如(ru)有(you)沈(chen)澱(dian)形成(cheng)，應(ying)該再(zai)次(ci)離(li)心。

3. 尿液：用無(wu)菌(jun)管收集(ji)，離(li)心20分鐘左(zuo)右（2000-3000轉/分）。仔(zai)細收集(ji)上(shang)清，保存(cun)過(guo)程中(zhong)如(ru)有(you)沈(chen)澱(dian)形成(cheng)，應(ying)再(zai)次(ci)離(li)心。胸(xiong)腹水(shui)、腦脊(ji)液參照實行。

4. 細胞(bao)培(pei)養(yang)上(shang)清：檢測分(fen)泌(mi)性(xing)的(de)成(cheng)份(fen)時(shi)，用無(wu)菌(jun)管收集(ji)。離(li)心20分鐘左(zuo)右（2000-3000轉/分）。仔(zai)細收集(ji)上(shang)清。檢測細胞(bao)內的(de)成(cheng)份(fen)時(shi)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋(shi)細胞(bao)懸(xuan)液，細胞(bao)濃(nong)度(du)達(da)到00萬/ml左(zuo)右。通過(guo)反復凍(dong)融(rong)，以(yi)使細胞(bao)破(po)壞(huai)並(bing)放出(chu)細胞(bao)內成(cheng)份(fen)。離心20分鐘左(zuo)右（2000-3000轉/分）。仔(zai)細收集(ji)上(shang)清。保存(cun)過(guo)程中(zhong)如(ru)有(you)沈(chen)澱(dian)形成(cheng)，應(ying)再(zai)次(ci)離(li)心。

5. 組(zu)織標(biao)本(ben)：切割標本(ben)後，稱(cheng)取重(zhong)量。加入(ru)壹(yi)定(ding)量的(de)PBS，PH7.4。用液氮迅(xun)速冷(leng)凍(dong)保存(cun)備用。標本(ben)融(rong)化(hua)後仍然保持(chi)2-8℃的(de)溫(wen)度。加(jia)入(ru)壹(yi)定(ding)量的(de)PBS（PH7.4），用手(shou)工或(huo)勻漿器將(jiang)標本(ben)勻漿充分。離(li)心20分鐘左(zuo)右（2000-3000轉/分）。仔(zai)細收集(ji)上(shang)清。分裝後壹(yi)份(fen)待檢測，其(qi)余冷(leng)凍(dong)備用。

6. 兔(tu)子膠原(yuan)酶(mei)Collagenase I標(biao)本(ben)采集(ji)後盡早(zao)進(jin)行提(ti)取(qu)，提(ti)取(qu)按相關文(wen)獻進行，提(ti)取(qu)後應(ying)盡快進行實驗(yan)。若不(bu)能(neng)馬上進行試(shi)驗，可(ke)將標(biao)本(ben)放於(yu)-20℃保(bao)存(cun)，但應(ying)避免反復凍(dong)融(rong).

7. 不(bu)能(neng)檢測含(han)NaN3的(de)樣(yang)品(pin)，因(yin)NaN3抑(yi)制(zhi)辣(la)根過(guo)氧化物(wu)酶(mei)的(de)（HRP）活性(xing)。