兔子(zi)脂(zhi)聯(lian)素（ADP）試劑盒(he)使(shi)用(yong)操作(zuo)說明(ming)

兔(tu)子脂(zhi)聯(lian)素（ADP）試劑盒(he)使(shi)用(yong)操作(zuo)說明(ming)

實驗原(yuan)理：
本試(shi)劑盒(he)應(ying)用(yong)雙抗體(ti)夾心法測定(ding)標本中兔子(zi)脂(zhi)聯(lian)素ADP水平。用(yong)純化(hua)的兔(tu)子脂(zhi)聯(lian)素（ADP）抗體(ti)包(bao)被微(wei)孔板(ban)，制(zhi)成(cheng)固相抗體(ti)，往(wang)包(bao)被單(dan)抗的(de)微(wei)孔中依次加入脂(zhi)聯(lian)素（ADP），再(zai)與HRP標記(ji)的脂(zhi)聯(lian)素（ADP）抗體(ti)結(jie)合(he)，形(xing)成抗體(ti)-抗(kang)原-酶標抗體(ti)復(fu)合(he)物(wu)，經(jing)過*洗(xi)滌(di)後(hou)加底(di)物(wu)TMB顯(xian)色(se)。TMB在(zai)HRP酶的催化下(xia)轉化(hua)成(cheng)藍色(se)，並在酸(suan)的作(zuo)用(yong)下(xia)轉化(hua)成(cheng)zui終(zhong)的黃色。顏色的(de)深淺(qian)和(he)樣(yang)品(pin)中的脂(zhi)聯(lian)素（ADP）呈正(zheng)相關。用(yong)酶標儀(yi)在(zai)450nm波長(chang)下(xia)測定(ding)吸光(guang)度（OD值(zhi)），通(tong)過標準曲線(xian)計算(suan)樣(yang)品(pin)中兔子(zi)脂(zhi)聯(lian)素（ADP）濃度。

操作(zuo)步驟

.        標準品(pin)的(de)稀(xi)釋(shi)與加樣：在(zai)酶標包(bao)被板(ban)上(shang)設標準品(pin)孔0孔，在*、第二(er)孔中分別(bie)加(jia)標準品(pin)00μl，然(ran)後(hou)在*、第二(er)孔中加標準品(pin)稀(xi)釋(shi)液50μl，混勻；然(ran)後(hou)從*孔、第二(er)孔中各取(qu)00μl分(fen)別(bie)加(jia)到第三孔和(he)第四孔，再(zai)在第三、第四孔分別(bie)加(jia)標準品(pin)稀(xi)釋(shi)液50μl，混勻；然(ran)後(hou)在第三孔和(he)第四孔中先各取50μl棄掉，再(zai)各取(qu)50μl分(fen)別(bie)加(jia)到第五(wu)、第六孔中，再(zai)在第五(wu)、第六孔中分別(bie)加(jia)標準品(pin)稀(xi)釋(shi)液50ul，混勻；混勻後(hou)從第五(wu)、第六孔中各取(qu)50μl分(fen)別(bie)加(jia)到第七(qi)、第八(ba)孔中，再(zai)在第七(qi)、第八(ba)孔中分別(bie)加(jia)標準品(pin)稀(xi)釋(shi)液50μl，混勻後(hou)從第七(qi)、第八(ba)孔中分別(bie)取(qu)50μl加到第九、第十(shi)孔中，再(zai)在第九第十(shi)孔分別(bie)加(jia)標準品(pin)稀(xi)釋(shi)液50μl，混勻後(hou)從第九第十(shi)孔中各取(qu)50μl棄(qi)掉。（稀(xi)釋(shi)後(hou)各孔加樣(yang)量都(dou)為(wei)50μl，濃(nong)度分別(bie)為(wei)800ng/L，200ng/L ，600ng/L，300ng/L， 50ng/L）。

2.         加(jia)樣(yang)：分(fen)別(bie)設(she)空白孔（空白對(dui)照孔不加(jia)樣(yang)品(pin)及酶標試劑，其(qi)余(yu)各(ge)步操作(zuo)相同）、待測樣(yang)品(pin)孔。在酶標包(bao)被板(ban)上(shang)待測樣(yang)品(pin)孔中先加樣品(pin)稀(xi)釋(shi)液40μl，然後(hou)再(zai)加待測樣(yang)品(pin)0μl（樣(yang)品(pin)zui終(zhong)稀(xi)釋(shi)度為(wei)5倍(bei)）。加樣(yang)將(jiang)樣(yang)品(pin)加(jia)於(yu)酶標板(ban)孔底部(bu)，盡量不觸及孔壁(bi)，輕輕晃(huang)動混勻。

3.         溫(wen)育(yu)：用(yong)封(feng)板(ban)膜封(feng)板(ban)後(hou)置37℃溫(wen)育(yu)30分鐘(zhong)。

4.         配液：將(jiang)30（48T的(de)20倍(bei)）倍(bei)濃縮(suo)洗(xi)滌(di)液(ye)用(yong)蒸(zheng)餾(liu)水30（48T的(de)20倍(bei)）倍(bei)稀(xi)釋(shi)後(hou)備用(yong)。

5.         洗(xi)滌(di)：小(xiao)心揭(jie)掉封(feng)板(ban)膜，棄(qi)去液體(ti)，甩幹(gan)，每(mei)孔加滿(man)洗(xi)滌(di)液(ye)，靜置(zhi)30秒(miao)後(hou)棄去(qu)，如此重復(fu)5次，拍幹(gan)。

6.         加(jia)酶：兔子脂(zhi)聯(lian)素ADP每孔加入(ru)酶標試劑50μl，空白孔除(chu)外(wai)。

7.         溫(wen)育(yu)：操作(zuo)同3。

8.         洗(xi)滌(di)：操作(zuo)同5。

9.         顯(xian)色(se)：每(mei)孔先加入顯(xian)色(se)劑A50μl，再(zai)加入(ru)顯(xian)色(se)劑B50μl，輕輕震(zhen)蕩混勻，37℃避(bi)光顯(xian)色(se)5分(fen)鐘(zhong).

0.     終(zhong)止：每(mei)孔加終(zhong)止液(ye)50μl，終(zhong)止反(fan)應(ying)（此時(shi)藍色立(li)轉黃色）。

.     測定(ding)：以(yi)空(kong)白空(kong)調零，450nm波(bo)長(chang)依序(xu)測量各(ge)孔的吸光(guang)度（OD值(zhi)）。 測定(ding)應(ying)在加終(zhong)止液(ye)後(hou)5分鐘(zhong)以(yi)內進(jin)行(xing)。

樣本處(chu)理及要(yao)求(qiu)：

. 血(xue)清(qing)：室(shi)溫血(xue)液(ye)自然(ran)凝固0-20分(fen)鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分(fen)）。仔(zai)細收(shou)集上(shang)清，保(bao)存過程(cheng)中如出現(xian)沈(chen)澱(dian)，應(ying)再(zai)次離心。

2. 血(xue)漿(jiang)：應(ying)根據(ju)標本的(de)要(yao)求(qiu)選(xuan)擇EDTA或檸(ning)檬(meng)酸(suan)鈉(na)作(zuo)為(wei)抗(kang)凝(ning)劑，混合(he)0-20分(fen)鐘後(hou)，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分(fen)）。仔(zai)細收(shou)集上(shang)清，保(bao)存過程(cheng)中如有沈(chen)澱(dian)形(xing)成(cheng)，應(ying)該再(zai)次離心。

3. 尿(niao)液(ye)：用(yong)無菌(jun)管收(shou)集，離(li)心20分鐘左右（2000-3000轉/分(fen)）。仔(zai)細收(shou)集上(shang)清，保(bao)存過程(cheng)中如有沈(chen)澱(dian)形(xing)成(cheng)，應(ying)再(zai)次離心。胸腹水、腦脊液參(can)照實行(xing)。

4. 細胞培養(yang)上(shang)清：檢(jian)測分(fen)泌(mi)性(xing)的(de)成份(fen)時(shi)，用(yong)無菌(jun)管收(shou)集。離(li)心20分鐘左右（2000-3000轉/分(fen)）。仔(zai)細收(shou)集上(shang)清。檢(jian)測細胞內的(de)成份(fen)時(shi)，用(yong)PBS（PH7.2-7.4）稀(xi)釋(shi)細胞懸(xuan)液(ye)，細胞濃(nong)度達到00萬/ml左右。通過反(fan)復(fu)凍融，以(yi)使(shi)細胞破(po)壞(huai)並放(fang)出細胞內成(cheng)份。離(li)心20分鐘左右（2000-3000轉/分(fen)）。仔(zai)細收(shou)集上(shang)清。保(bao)存過程(cheng)中如有沈(chen)澱(dian)形(xing)成(cheng)，應(ying)再(zai)次離心。

5. 組織標本：切(qie)割標本後(hou)，稱(cheng)取(qu)重量。加(jia)入壹(yi)定(ding)量的(de)PBS，PH7.4。用(yong)液氮(dan)迅速冷凍保存備用(yong)。標本融(rong)化後(hou)仍然(ran)保(bao)持2-8℃的溫度。加入壹(yi)定(ding)量的(de)PBS（PH7.4），用(yong)手(shou)工或勻(yun)漿(jiang)器(qi)將(jiang)標本勻(yun)漿充分(fen)。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分(fen)）。仔(zai)細收(shou)集上(shang)清。分(fen)裝(zhuang)後(hou)壹(yi)份(fen)待檢測，其(qi)余(yu)冷(leng)凍備用(yong)。

6. 標本采(cai)集後(hou)盡早(zao)進(jin)行(xing)提取，提取(qu)按(an)相關文(wen)獻(xian)進(jin)行(xing)，提取後(hou)應(ying)盡快(kuai)進(jin)行(xing)實驗。若(ruo)不能(neng)馬上(shang)進(jin)行(xing)試驗，可(ke)將(jiang)標本放(fang)於(yu)-20℃保(bao)存，但應(ying)避免反(fan)復(fu)凍融.

7. 不能(neng)檢(jian)測含(han)NaN3的(de)樣(yang)品(pin)，因(yin)NaN3抑制(zhi)辣根過氧化物(wu)酶的（HRP）活性。

註(zhu)意事(shi)項：

．  試(shi)劑盒(he)從冷(leng)藏(zang)環(huan)境中取出應(ying)在室溫(wen)平衡5-30分鐘後(hou)方可(ke)使用(yong)，酶標包(bao)被板(ban)開封(feng)後(hou)如未(wei)用(yong)完(wan)，板(ban)條(tiao)應(ying)裝(zhuang)入密(mi)封(feng)袋中保存。

2．  濃(nong)洗(xi)滌(di)液(ye)可(ke)能會有結(jie)晶析(xi)出，稀(xi)釋(shi)時(shi)可(ke)在水浴中加溫(wen)助(zhu)溶(rong)，洗(xi)滌(di)時(shi)不影(ying)響(xiang)結(jie)果。

3．  各步加(jia)樣(yang)均(jun)應(ying)使用(yong)加樣(yang)器(qi)，並經(jing)常(chang)校(xiao)對(dui)其(qi)準確性，以(yi)避(bi)免試驗誤(wu)差。壹(yi)次加樣時(shi)間(jian)控制(zhi)在(zai)5分鐘內，如標本數(shu)量多(duo)，使用(yong)排槍(qiang)加樣。

4．  請每(mei)次測定(ding)的(de)同時(shi)做標準曲線(xian)，做復(fu)孔。如標本中待測物(wu)質含量過高（樣本OD值(zhi)大於(yu)標準品(pin)孔*孔的OD值(zhi)），請(qing)先用(yong)樣品(pin)稀(xi)釋(shi)液稀(xi)釋(shi)壹(yi)定(ding)倍(bei)數（n倍(bei)）後(hou)再(zai)測定(ding)，計算(suan)時(shi)請zui後(hou)乘以(yi)總(zong)稀(xi)釋(shi)倍(bei)數（×n×5）。

5．  封(feng)板(ban)膜只(zhi)限(xian)壹(yi)次性使用(yong)，以避(bi)免交(jiao)叉汙染。

6．  底物(wu)請避(bi)光保(bao)存。

7．  嚴(yan)格(ge)按(an)照說(shuo)明(ming)書的(de)操作(zuo)進(jin)行(xing)，試驗結(jie)果判(pan)定必(bi)須以(yi)酶標儀(yi)讀(du)數為(wei)準(zhun).

8．  兔(tu)子(zi)脂(zhi)聯(lian)素ADP所(suo)有樣(yang)品(pin)，洗(xi)滌(di)液(ye)和(he)各(ge)種(zhong)廢(fei)棄物(wu)都應(ying)按傳染物(wu)處(chu)理。

9．  本(ben)試(shi)劑不同批(pi)號(hao)組分(fen)不得(de)混用(yong)。

0. 如與英(ying)文(wen)說(shuo)明(ming)書有(you)異(yi)，以(yi)英(ying)文(wen)說(shuo)明(ming)書為(wei)準(zhun)。