SP三(san)步(bu)法操作步(bu)驟(zhou)

操(cao)作(zuo)步(bu)驟：

、脫蠟(la)：60℃ 20min；二(er)甲苯I0min 、二(er)甲苯II0min。

2、梯度酒(jiu)精脫(tuo)水：00%EtOH I 5min 、00%EtOH II 5min、95%EtOH 3min、80% EtOH 3min、70% EtOH 3min。抗體

3、滅(mie)活內(nei)源(yuan)性過氧化物(wu)酶：3%H2O2 常溫(wen)下(xia)避光孵育(yu)0min，PBS沖洗(xi)3次(ci)×3min；

4、抗原修(xiu)復：置(zhi)0.0M枸(gou)櫞(yuan)酸緩(huan)沖液(ye)（PH 6.0）中用煮沸(fei)（微波(bo)爐可(ke)高火4次(ci)×6min），自然(ran)冷卻30min 以上(shang)，至(zhi)室(shi)溫(wen)後PBS沖洗(xi)3次(ci)×3min。

5、封(feng)閉(bi)：用封閉液(ye)（壹般與(yu)二(er)抗來(lai)源(yuan)壹致，如(ru)正(zheng)常羊血(xue)清(qing)工(gong)作液(ye)）封閉(bi)，常溫(wen)下(xia)0~30min，傾去勿洗(xi)。

6、壹(yi)抗孵育：滴(di)加適(shi)宜(yi)濃(nong)度(du)的(de)壹(yi)抗4℃ 冰(bing)箱孵(fu)育(yu)過夜(ye)（zui常用），37℃復溫(wen)45min，PBS沖洗(xi)5次(ci)×3min（用PBS緩沖液(ye)代替壹(yi)抗作陰(yin)性(xing)對(dui)照(zhao)）；

7、二(er)抗孵育：滴(di)加標(biao)記二(er)抗，37℃孵育30min, PBS沖洗(xi)5次(ci)×3min；

8、SP反(fan)應(ying)：滴加(jia)辣根(gen)過氧化物(wu)酶標(biao)記的(de)鏈(lian)黴(mei)親和(he)素(su)工(gong)作(zuo)液(ye)，37℃孵育(yu)30min，PBS沖洗(xi)5次(ci)×3min；

9、DAB顯(xian)色(se)：配(pei)置(zhi)DAB/H2O2反(fan)應(ying)液(ye)孵育(yu)組(zu)織(zhi)切(qie)片(pian)，鏡(jing)下控制(zhi)染色，壹般3~0min，自來(lai)水充分(fen)沖洗(xi)；

0、蘇(su)木(mu)素(su)復(fu)染：壹般胞(bao)漿蛋(dan)白(bai)或(huo)胞(bao)膜蛋(dan)白(bai)可(ke)以(yi)適(shi)當(dang)染至幾十(shi)秒(miao)~幾分(fen)鐘(zhong)，但(dan)細(xi)胞(bao)核蛋(dan)白(bai)在幾(ji)秒(miao)。若(ruo)過染，可(ke)以(yi)用%HCl褪(tui)色(se)；抗體

、常規脫水：50% ethanol -2min、70% ethanol -2min、95% ethanol -2min、95% ethanol -2min、00% absolute ethanol: （-2）min、00% absolute ethanol: （-2）min；

2、透明：Xylene ×（-2）min→Xylene 2×（-2）min；

3、封(feng)片(pian)：中(zhong)性樹膠。

註(zhu)意(yi)事項

、蘇(su)木(mu)素(su)復(fu)染時(shi)間(jian)需(xu)要(yao)摸索，尤(you)其陽性(xing)染色也在細(xi)胞(bao)核上(shang)。

2、DAB顯(xian)色(se)時(shi)間(jian)需(xu)要(yao)達到(dao)*化，鏡(jing)下觀(guan)察達到(dao)陽(yang)性染色明顯(xian)但(dan)背(bei)景(jing)不(bu)太(tai)深。

3、抗體孵育(yu)時(shi)間(jian)和(he)抗體濃度(du)需要(yao)摸索。尤(you)其壹抗孵育在(zai)4度過夜(ye)。

4、切(qie)片(pian)脫(tuo)蠟(la)和(he)水化要(yao)充分(fen)；加反(fan)應(ying)液(ye)時(shi)要(yao)覆(fu)蓋組織(zhi)充分(fen)；每(mei)次(ci)加(jia)液(ye)前(qian)甩(shuai)幹洗(xi)滌(di)液(ye)，但(dan)又防(fang)止幹(gan)片(pian)；用組化筆畫圈時(shi)盡(jin)量畫(hua)大壹(yi)點，否(fou)則墨水排斥(chi)液(ye)體，引(yin)起片(pian)周(zhou)邊(bian)幹(gan)片(pian)。