小鼠Treg檢測操(cao)作(zuo)步驟(zhou)

、在(zai)每個(ge)流式上樣管中(zhong)加入00 μl準備好的細胞懸(xuan)液，細胞數(shu)約為(wei)x06個(ge).

2、按(an)照細胞表(biao)面抗原(yuan)染色方(fang)法標(biao)記(ji)表(biao)面抗原(yuan)。根據(ju)說明書加入CD4和(he)CD25抗(kang)體00 μl體系中(zhong)使(shi)用(yong)0.25 μg FITC anti-mouse CD4，0.06 μg APC anti-mouse CD25抗體。根據(ju)這些試劑詳細的說(shuo)明書操作(zuo)。4 ℃孵(fu)育(yu)30 分鐘。孵(fu)育表面抗體(ti)之前(qian)加入Fc受體(ti)阻(zu)斷(duan)劑(ji)。 

3、用(yong)預(yu)冷(leng)流式染色緩(huan)沖溶(rong)液洗滌(di)細胞（離心(xin)並(bing)轉移(yi)）。

4、旋渦震蕩(dang)重懸(xuan)細胞後(hou)加入ml的固定(ding)/破膜工作(zuo)液（Fixation/Permeabilization）（:3稀(xi)釋好），並(bing)再次(ci)旋渦混勻。

5、避光4℃孵(fu)育30分鐘到8小時（孵(fu)育30分鐘到8小時，結果(guo)壹(yi)樣）。

6、加入2ml 破膜緩(huan)沖液（Permeabilization Buffer）（:9去離子(zi)水(shui)稀(xi)釋）離心(xin)洗滌(di)細胞並(bing)棄去上(shang)清液。

7、重復(fu)第6步操(cao)作(zuo)洗(xi)滌(di)細胞。

8、（可選）加入含(han)0.5 μg Fc受(shou)體(ti)阻(zu)斷(duan)劑的破膜緩(huan)沖液，保證00 μl體系4 ℃孵育(yu)5分鐘。

9、封(feng)閉液無需(xu)洗(xi)去(qu)，體(ti)系(xi)加入0.5 μg PE anti-mouse/rat Foxp3抗體(ti)和(he)PE Rat lgG2a同(tong)型(xing)對照(zhao)（用(yong)Permeabilization Buffer工作(zuo)液進行稀(xi)釋），避光4℃孵(fu)育(yu)至(zhi)少(shao)30分鐘。建(jian)議進(jin)行預(yu)實(shi)驗(yan)摸索出(chu)抗(kang)體的zui適濃(nong)度(du)。

0、加入2ml破膜工作(zuo)液離心(xin)洗滌(di)細胞並(bing)棄去上(shang)清液。

、重復(fu)上壹(yi)步洗(xi)滌細胞。

    用(yong)適量體(ti)積(ji)的(de)Flow Cytometry Staining Buffer重懸(xuan)細胞，並(bing)上機檢測並(bing)分析(xi)。註：由(you)於染色過程中(zhong)使(shi)用(yong)了細胞固定(ding)和(he)破膜，對比起活細胞在(zai)形態上會(hui)有壹(yi)定(ding)變(bian)化。