血(xue)管平滑(hua)肌細胞(bao)結果分(fen)析(xi)與(yu)鑒定(ding)

結果分(fen)析(xi)與(yu)鑒定(ding)

(壹(yi))細胞(bao)觀(guan)察(cha)

．在倒置(zhi)相(xiang)差顯(xian)微(wei)鏡下，當(dang)細(xi)胞(bao)長(chang)滿瓶(ping)底(di)時，典型的(de)平(ping)滑肌細胞(bao)為(wei)梭形，平(ping)行(xing)呈束狀排列，密集與稀疏交(jiao)叉(cha)呈“峰(feng)"與“谷(gu)"狀，峰(feng)處細胞密集、多(duo)層(ceng)；谷(gu)處細(xi)胞稀(xi)疏(shu)甚至沒(mei)有(you)細胞(bao)。

2．電(dian)鏡下觀(guan)察(cha)，可把平(ping)滑(hua)肌細胞(bao)分(fen)為(wei)“合成(cheng)型"與(yu)“收(shou)縮(suo)型"兩(liang)型。前(qian)者胞質(zhi)充滿楹(ying)面(mian)內(nei)質網，但粗(cu)肌絲或(huo)細肌絲很(hen)少，肌動蛋白的(de)抗體熒(ying)光染色(se)為(wei)陰(yin)性，細胞無收縮(suo)功能(neng)。“收縮(suo)型"細(xi)胞(bao)是平(ping)滑(hua)肌細胞(bao)的典(dian)型表(biao)現，主(zhu)要特(te)征(zheng)為(wei)胞質(zhi)內(nei)有束狀肌絲，細(xi)胞有(you)收(shou)縮(suo)功能(neng)。

3．原代(dai)培養的zui初周(zhou)內(nei)細胞(bao)以(yi)“收(shou)縮(suo)型"為(wei)主(zhu)，以後(hou)逐(zhu)漸(jian)向(xiang)“合成(cheng)型"轉(zhuan)化(hua)且大量繁(fan)殖(zhi)。傳(chuan)代(dai)培養zui初從“收(shou)縮(suo)型"向(xiang)“合成(cheng)型"轉(zhuan)化(hua)很(hen)快，6～0d後(hou)又(you)復(fu)原，但已(yi)無收譬(pi)功能(neng)。

(二)MTT比色(se)法

．MTT能(neng)進入(ru)活(huo)的線粒體內(nei)，與各(ge)種(zhong)脫(tuo)氫(qing)酶(mei)反應，可(ke)用(yong)於測(ce)定(ding)細(xi)胞(bao)的(de)成(cheng)活及(ji)增殖。

2．以PBS溶解(jie)MTT制(zhi)成(cheng)5mg／ml溶液(ye)，抽濾滅菌。按每(mei)孔(kong)00μl培(pei)養液加(jia)入0μl的(de)量把MTT加(jia)入細(xi)胞培(pei)養孔(kong)內(nei)，在37℃繼(ji)續(xu)培養4 h。

3．取出培(pei)養板(ban)，吸出孔(kong)中(zhong)培(pei)養液，每(mei)孔(kong)加(jia)入00μl酸(suan)性異丙(bing)醇(chun)(含0．04 ml／L HCl)，使深藍色結晶*溶解(jie)。

4．在(zai)室(shi)溫下放(fang)置(zhi)數分(fen)鐘，確(que)認(ren)結晶*溶解(jie)後(hou)即(ji)把培(pei)養板(ban)在(zai)570 nm、630 nm處．控l設在．99(如樣(yang)品(pin)著(zhe)色(se)過(guo)強(qiang)，則(ze)設在．00)的(de)多(duo)7L掃(sao)描(miao)分(fen)光光度(du)計下讀(du)數。在加(jia)入異丙(bing)後(hou)l h內(nei)測(ce)定(ding)完(wan)畢(bi)。

5．也(ye)可(ke)以(yi)使用(yong)DMSO每(mei)孔(kong)320μl代(dai)替(ti)異丙(bing)醇(chun)溶解(jie)細(xi)胞內(nei)MTT，在酶(mei)聯免(mian)疫測(ce)定(ding)儀(yi)上(shang)司(si)570nm或(huo)570 nm、630 nm雙波長處(chu)測(ce)定(ding)吸光值(zhi)並(bing)分(fen)析(xi)。

(三(san))3 H-TdR放(fang)射(she)免(mian)疫測(ce)定(ding)

．將(jiang)待測(ce)細(xi)胞(bao)吸去培養液，每(mei)孔(kong)加(jia)入含3 H—TdR的培養液200μl(含放(fang)射(she)量3．7×0 4Bq)，37℃孵(fu)育(yu)24 h後終止培養。

2．以冷(leng)PBS200μl清(qing)洗(xi)3次(ci)，加(jia)入4℃的(de)0％TCA 200 μl，放(fang)於(yu)4℃冰箱(xiang)內(nei)30 min。

3．吸去TCA，加(jia)入乙(yi)醚(mi)壹(yi)乙(yi)醇(chun)(：2)混合液200μl漂(piao)洗，吸去液體，晾(liang)幹。

4．加(jia)入O．4 mol／L NaOH溶(rong)液每(mei)孔(kong)200μl溶(rong)解(jie)細(xi)胞，在56℃恒溫(wen)箱(xiang)中(zhong)放(fang)置(zhi)2h。

5．吸出全(quan)部液體，註(zhu)入(ru)含有5ml閃爍液(ye)的(de)閃爍瓶(ping)中(zhong)，加(jia)蓋搖勻(yun)，放(fang)置(zhi)2h後進行(xing)液(ye)閃測(ce)定(ding)。