檢(jian)測淋(lin)巴(ba)母細(xi)胞(bao)的IL壹(yi)2受(shou)體(ti)

．原(yuan)理有(you)絲(si)分(fen)裂(lie)原(yuan)可以(yi)使淋(lin)巴(ba)細(xi)胞轉化為淋(lin)巴(ba)母細(xi)胞(bao)。淋巴(ba)母細(xi)胞(bao)表達(da)豐富(fu)的IL壹(yi)2受(shou)體(ti)，該(gai)細胞(bao)在體外IL壹(yi)2存(cun)在(zai)時能(neng)連續(xu)培養，並(bing)與(yu)IL壹(yi)2含(han)量呈(cheng)劑(ji)量依賴(lai)關(guan)系。它(ta)對(dui)有絲(si)分(fen)裂(lie)原(yuan)無(wu)反(fan)應(ying)性或反應(ying)極微(wei)。因此(ci)，在(zai)無IL-2依賴(lai)細胞(bao)株(zhu)的(de)情況(kuang)下(xia)，可以(yi)用此細胞(bao)作IL壹(yi)2檢(jian)測。

2．材料(liao)

()IL-2待(dai)測樣品(pin)，用0％FCS RPMI 640培養液(ye)倍比(bi)稀(xi)釋(shi)。

(2)IL壹(yi)2、刀(dao)豆(dou)蛋白(bai)A(ConA)標(biao)準(zhun)品(pin)。

(3)C57BL／6小(xiao)鼠。

(4)3 H—TdR(0．5 μci／50μl)。

(5)閃爍液(ye)。

(6)9999型玻(bo)璃(li)纖維(wei)濾紙(zhi)。

(7)細胞(bao)收集(ji)儀(yi)。

(8)8液(ye)閃計數儀(yi)。

3．方(fang)法(fa)

()取C57BL／6小鼠脾臟磨(mo)碎(sui)後(hou)，配(pei)成5×06／ml單個細(xi)胞(bao)懸液(ye)。

(2)加(jia)入ConA 5 μg／ml，37℃、5％CO2孵(fu)箱(xiang)中培養40～48h。

(3)將(jiang)培養的細胞懸(xuan)液(ye)置(zhi)於(yu)淋巴(ba)細(xi)胞分(fen)層液(ye)上(shang)，700 r／mln離(li)心(xin)5 min。取界面層細胞(bao)即為(wei)IL壹(yi)2反(fan)應(ying)細胞(淋巴(ba)母細(xi)胞(bao))。

(4)將(jiang)反(fan)應(ying)細胞配成×06／ml的(de)懸(xuan)液(ye)，取00μl加(jia)入96孔(kong)微(wei)量培養板。

(5)加(jia)入00μl待(dai)測樣品(pin)或(huo)IL壹(yi)2標(biao)準(zhun)品(pin)，37℃、5％CO2孵(fu)箱(xiang)中培養40～48h。

(6)每孔加(jia)入O．5μci。H—TdR，37℃、5％CO2孵(fu)箱(xiang)中培養4～6 h。

(7)收集(ji)細(xi)胞測定3 H—TdR摻人(ren)量。

4．結(jie)果分(fen)析(xi)以(yi)不同(tong)稀(xi)釋(shi)度的IL壹(yi)2標(biao)準(zhun)品(pin)繪(hui)制標(biao)準曲(qu)線(xian)，從(cong)IL壹(yi)2標(biao)準(zhun)曲(qu)線(xian)上(shang)測得樣品(pin)中(zhong)IL壹(yi)2的(de)活(huo)性單位。

5．註(zhu)意(yi)事(shi)項

()此法(fa)不必培養CTLL-2細胞。但由(you)於(yu)動物(wu)的個(ge)體差(cha)異，往(wang)往(wang)使試(shi)驗(yan)結(jie)果(guo)批(pi)次間差(cha)異較大。

(2)淋巴(ba)母細(xi)胞(bao)的誘(you)導和(he)分(fen)離(li)技(ji)術(shu)不易掌握(wo)，有(you)時容(rong)易(yi)混入較(jiao)多的(de)休止(zhi)期小淋(lin)巴(ba)細(xi)胞，這些細胞(bao)仍(reng)保留(liu)對(dui)ConA的反(fan)應(ying)性。因此(ci)，作為(wei)檢(jian)測細(xi)胞所含(han)休(xiu)止(zhi)期小細(xi)胞不宜(yi)超過(guo)5%並(bing)應(ying)設ConA反應(ying)對(dui)照(zhao)組(zu)。

(3)細胞培養收獲的時間壹(yi)般(ban)應(ying)以(yi)無IL壹(yi)2的(de)對(dui)照(zhao)細(xi)胞絕(jue)大多(duo)數死亡，而(er)加(jia)IL壹(yi)2的(de)實驗(yan)組(zu)細(xi)胞(bao)生長旺盛(sheng)時為(wei)佳(jia)。