傳代(dai)培養細胞的方法

方法

()培養細胞：取處(chu)於指數生，用較(jiao)大(da)平(ping)皿(min)培養的(de)，80％～90％匯(hui)合單(dan)層培養細胞。

(2)加秋水仙(xian)素：使用zui終濃度(du)為O．02～O．8gg／ml營養液；溫箱繼(ji)續(xu)培養6～0h；麥(mai)用低(di)溫封(feng)閉法：把培養細胞置於(yu)4℃條件(jian)下6～2h後(hou)，再於(yu)37℃溫箱中(zhong)繼(ji)續(xu)培養6～0h處(chu)理(加秋水仙(xian)素)。

(3)采(cai)集分裂細胞：可利(li)用分裂(lie)中期(qi)細胞體變(bian)圓與底物附著不(bu)牢特點，此(ci)時(shi)手持培養瓶(ping)，左(zuo)右反(fan)復(fu)橫向水平(ping)搖(yao)動，令(ling)培養液在培養細胞表(biao)面反(fan)復(fu)沖洗，應(ying)用此(ci)法(fa)可使90％的中期(qi)分裂細胞從瓶(ping)壁脫(tuo)落；註意勿用力過猛(meng)，以(yi)防多量非(fei)分裂(lie)細胞脫(tuo)落影響(xiang)觀(guan)察。

(4)離心：收(shou)集培養液，000r／min離心5～lOmin。

(5)低(di)滲(shen)處(chu)理：吸除上(shang)清液、加入(ru)預溫(wen)至37℃的(de)0．075 mol／L KCl溶(rong)液，在溫箱中(zhong)靜(jing)置(zhi)
20～30min．

(6)預(yu)固(gu)定(ding)：向懸液中加(jia)新鮮：3醋(cu)酸(suan)、甲醇固(gu)定(ding)液lml，用吸管(guan)吹(chui)打(da)均(jun)勻；此(ci)措(cuo)施(shi)能起(qi)到(dao)先(xian)使細胞表(biao)面輕(qing)微固定(ding)，可防止固(gu)定(ding)後(hou)細胞粘連(lian)成塊(kuai)。

(7)固(gu)定(ding)；離心，同(tong)(4)，吸除(chu)上(shang)清液，加新鮮固(gu)定(ding)劑5~0ml；加固(gu)定(ding)劑時要(yao)用壹手微斜(xie)持離心管(guan)，另(ling)手用吸管(guan)吸取固定(ding)劑，把固(gu)定(ding)劑逐滴(di)滴(di)在離心管(guan)壁上(shang)·使之慢慢流(liu)人(ren)離心管(guan)中，然後輕(qing)輕吹(chui)打(da)均(jun)勻，置(zhi)5~20min。

(8)重復(fu)(7)，末(mo)次離心後(hou)，小心吸(xi)除大(da)部(bu)上清液，據懸液中細胞密度(du)大(da)小，余下固(gu)定(ding)液0．5～ml。

(9)制(zhi)片：用滴(di)片法制(zhi)片，按如(ru)下步驟(zhou)：*洗凈(jing)載(zai)物片，勿留(liu)任(ren)何(he)油(you)脂(zhi)，置(zhi)冰(bing)箱中(zhong)儲存(cun)備(bei)用。滴(di)片前先從冰箱中(zhong)取出冷(leng)載(zai)物片張，在載(zai)物片表(biao)面出現(xian)細微水氣(qi)時，立(li)即(ji)向片的壹側滴(di)2～3滴(di)細胞懸液(如固(gu)定(ding)液不(bu)散(san)，可能因載(zai)物片未洗凈(jing)或(huo)不(bu)冷(leng)所(suo)致(zhi))·滴(di)片時的(de)距離能保持半(ban)米(mi)高度(du)才(cai)好(hao)。滴(di)片後置(zhi)室溫(wen)中(zhong)令其自然幹燥(zao)，或(huo)用吹(chui)風(feng)機熱(re)風吹(chui)幹(gan)亦可。如(ru)此(ci)制(zhi)備(bei)好(hao)的標(biao)本(ben)可置(zhi)盒中備(bei)用(做顯(xian)帶或(huo)熒(ying)光觀察等(deng))或(huo)立(li)即(ji)進行染色(se)觀察。

(0)染(ran)色(se)和封(feng)片：壹般(ban)常(chang)用Giemsa染色(se)；取幹液Giemsa 份(fen)加(jia)pH6．8磷酸(suan)緩沖液9份(fen)混合(he)，染(ran)色0min後(hou)，水洗、晾幹、可直(zhi)接(jie)觀察(使用油(you)浸(jin)鏡)；如標(biao)本(ben)需要(yao)保(bao)存(cun)或(huo)做(zuo)長時間觀察，可過二甲苯兩次後，用中性(xing)樹(shu)膠封片(或(huo)先(xian)迅速過丙酮兩次，每次30s)後，再過二甲苯，然後封(feng)片亦可。