雞胚原(yuan)代細(xi)胞(bao)制備及培養(yang)技術(shu)

)訓練目(mu)的

    了(le)解雞胚的(de)發育(yu)過程；掌(zhang)握(wo)雞胚原(yuan)代細(xi)胞(bao)制備及培養(yang)技術(shu)。

2)實(shi)驗(yan)材(cai)料

①試(shi)劑：Hank’s液(ye)、含0％～20％血(xue)清的細胞(bao)培養液(ye)、碘酊棉(mian)、酒精(jing)棉、0．25％。

②器(qi)材(cai)：超(chao)凈工作臺(tai)或(huo)生物(wu)安全(quan)櫃(gui)、細(xi)胞(bao)培養瓶(ping)、洗耳(er)球(qiu)、滅(mie)菌吸(xi)管、平(ping)皿、毛細(xi)吸(xi)管、離(li)心管(guan)、剪(jian)刀(dao)、小鑷(nie)子、CO2培(pei)養(yang)箱、倒置顯微(wei)鏡。

3)操(cao)作步(bu)驟(zhou)

()雞胚的(de)孵育(yu)

受(shou)精(jing)雞胚放在蛋(dan)托上，大(da)頭朝(chao)上，放人(ren)溫箱培養。在溫箱底(di)部放上壹(yi)盤水，溫度(du)調至37．8℃。

(2)雞胚的(de)發育(yu)過程

①觀察方法：將9～2 d的雞胚取(qu)出，放人(ren)平(ping)皿中(zhong)進(jin)行(xing)觀察。

②雞胚的(de)發育(yu)：采(cai)用雞胚進(jin)行(xing)細胞(bao)培養時(shi)，應(ying)對雞胚的(de)發育(yu)有(you)壹(yi)個(ge)初步了(le)解。雞胚的(de)發育(yu)是由(you)受(shou)精(jing)卵開始(shi)的(de)。它(ta)在通過輸卵(luan)管時(shi)，已(yi)開始(shi)分裂(lie)，當(dang)產(chan)卵(luan)時(shi)已(yi)在卵(luan)黃(huang)上部形成壹層細孢(bao)，稱(cheng)為(wei)胚盤，在適宜的(de)條(tiao)件(jian)下(xia)胚(pei)盤繼續分裂(lie)生長(chang)。在發育(yu)過程中(zhong)從(cong)卵(luan)黃(huang)和卵(luan)白(bai)中(zhong)獲(huo)取(qu)養料(liao)和水(shui)分．由(you)於(yu)胚體(ti)和卵(luan)黃(huang)分開的(de)緣故，胚胎只(zhi)通過卵黃(huang)帶(dai)與(yu)卵(luan)黃(huang)相(xiang)連(lian)。發育(yu)的(de)早期(qi)形(xing)成(cheng)3個(ge)胚層，即外(wai)胚(pei)層、中(zhong)胚(pei)層和內(nei)胚(pei)層，由此(ci)形(xing)成的胚(pei)胎的(de)各(ge)個(ge)器(qi)官(guan)和組(zu)織(zhi)。壹般(ban)孵(fu)育(yu)至3 d出現(xian)尿(niao)囊，為(wei)直腸(chang)側(ce)部分的(de)膨(peng)出物(wu)，尿(niao)囊膜(mo)是由(you)內(nei)胚(pei)層和中(zhong)胚(pei)層構成(cheng)的。至第(di)4～5 d胚(pei)體(ti)出現(xian)羊膜(mo)、尿(niao)囊膜(mo)及絨(rong)毛膜(mo)層包被。羊膜(mo)系(xi)由外胚(pei)層和中(zhong)胚(pei)層組成(cheng)，開始(shi)時(shi)緊(jin)貼(tie)於(yu)胚體(ti)上，後(hou)來(lai)腔內(nei)逐(zhu)漸充滿(man)羊水(shui)。尿(niao)囊膜(mo)在生長(chang)發育(yu)的(de)過程中(zhong)，與(yu)絨(rong)毛膜(mo)相(xiang)連(lian)而(er)成(cheng)絨(rong)毛尿(niao)囊膜(mo)，此膜(mo)由(you)三層細胞(bao)組成：外層為外(wai)胚(pei)層，內(nei)層為內(nei)胚(pei)層，中(zhong)間(jian)為(wei)中(zhong)胚(pei)層，其中(zhong)有(you)很(hen)多(duo)血(xue)管(guan)，有(you)兩(liang)條(tiao)主動(dong)脈(mai)自(zi)卵黃(huang)囊(nang)延(yan)伸到(dao)此膜中(zhong)，與(yu)此(ci)並行(xing)有(you)兩(liang)條(tiao)主靜脈(mai)，匯成(cheng)壹(yi)較(jiao)大(da)的尿(niao)囊靜(jing)脈。絨(rong)毛尿(niao)囊膜(mo)是雞胚的(de)呼吸(xi)器(qi)官(guan)，位(wei)於(yu)殼膜之(zhi)內(nei)。此(ci)膜生長(chang)發育(yu)很(hen)快(kuai)，第0 d已(yi)包圍(wei)了(le)整(zheng)個(ge)雞胚，此(ci)時(shi)雞胚已(yi)出現(xian)羽(yu)毛，呼吸(xi)道的發育(yu)在第(di)2～5 d出現(xian)。胚(pei)胎(tai)體(ti)積(ji)逐漸增大(da)時(shi)，胚(pei)胎腔外體(ti)液(ye)El趨減(jian)少(shao)，孵(fu)出小雞時(shi)已(yi)無胚(pei)胎腔外體(ti)液(ye)。在發育(yu)早期(qi)，尿(niao)囊液(ye)及羊水(shui)的(de)成(cheng)分與(yu)生理鹽水(shui)溶液(ye)相(xiang)差(cha)無(wu)幾，2 d後(hou)羊水(shui)的(de)蛋(dan)白含量及黏稠度(du)增加(jia)，尿(niao)囊腔積(ji)累了(le)腎(shen)臟(zang)的排泄(xie)物，因(yin)此(ci)，在2 d或(huo)3 d後(hou)，尿(niao)囊液(ye)由於(yu)尿(niao)酸(suan)鹽(yan)的(de)存(cun)在，使(shi)原來(lai)透(tou)明(ming)的液(ye)體(ti)呈現(xian)混(hun)濁(zhuo)。尿(niao)囊液(ye)的酸(suan)堿(jian)度(du)在7—2 d期(qi)間(jian)呈(cheng)弱(ruo)堿性，在孵(fu)育(yu)的(de)末期(qi)為(wei)pH 6．O。6～3 d雞胚羊水(shui)的(de)平(ping)均(jun)量為5—0mL，至3 d有(you)時(shi)可(ke)達(da)lO mL。卵白(bai)的水分在發育(yu)的(de)zui初7 d中(zhong)轉(zhuan)移到(dao)卵黃(huang)囊(nang)內(nei)，在第(di)6 d卵白轉入(ru)羊水(shui)腔為胚(pei)胎(tai)所吞(tun)食(shi)。卵黃(huang)在發育(yu)時(shi)逐(zhu)漸被壹(yi)層細胞(bao)包圍，自2 d以後(hou)卵(luan)黃(huang)逐(zhu)漸(jian)幹(gan)燥(zao)，在孵(fu)出之(zhi)後(hou)24～48 h，整(zheng)個(ge)卵黃(huang)囊(nang)被吸(xi)入(ru)小雞腹腔內(nei)，供(gong)雛(chu)雞出生後(hou)zui初幾天(tian)的(de)營(ying)養(yang)。

(3)雞胚原(yuan)代的(de)細(xi)胞(bao)培養

①消毒：選(xuan)9～2 d的雞胚2—3個(ge)放入(ru)超(chao)凈工作臺(tai)中(zhong)，大(da)頭(氣室)朝上放置，先(xian)用(yong)碘(dian)酊棉(mian)，消毒氣室部位(wei)。

②取(qu)雞胚：用(yong)鑷子剝(bo)去頭、四(si)肢(zhi)及內(nei)臟(zang)，洗2—3次，用Hank's液(ye)洗去(qu)紅(hong)細胞(bao)，吸(xi)去液(ye)體(ti)。

③剪碎(sui)雞胚及(ji)清洗：用小剪(jian)刀(dao)將(jiang)雞胚反(fan)復剪碎成泥(ni)狀，加(jia)Hank's液(ye)，吸(xi)入(ru)細胞(bao)培養瓶(ping)，稍(shao)靜置，讓組織(zhi)下(xia)沈，吸(xi)去液(ye)體(ti)。用Hank's液(ye)洗2～3次，吸(xi)去液(ye)體(ti)，以去除紅(hong)細胞(bao)等。

④加(jia)：根據組織(zhi)的多少(shao)加(jia)入(ru)壹定(ding)量的O．25％，的量以將組織(zhi)塊浸泡在中(zhong)為(wei)適中(zhong)，壹(yi)個(ge)雞胚壹(yi)般(ban)加(jia)0．25％的4～5 mL。

⑤消化：用膠塞(sai)封緊，輕(qing)搖均(jun)勻(yun)，置4℃冰箱靜置過夜(ye)或(huo)37 ℃水浴(yu)消化 h。

⑥洗去(qu)：消化完畢(bi)後(hou)，吸(xi)出，用(yong)Hank's液(ye)或(huo)PBS洗3次以洗去，吸(xi)去洗(xi)液(ye)後(hou)。洗(xi)時(shi)註(zhu)意輕(qing)搖，如(ru)猛(meng)烈搖動(dong)，會(hui)將(jiang)組織(zhi)塊搖散(san)，吸(xi)去洗(xi)液(ye)後(hou)，用(yong)營(ying)養(yang)液(ye)將細(xi)胞(bao)洗出，放入(ru)培養(yang)瓶(ping)。

⑦計數(shu)培養(yang)：加(jia)入(ru)適量的*培養液(ye)(0～20 mL)，用吸(xi)管反(fan)復(fu)吹(chui)打形(xing)成細(xi)胞(bao)懸液(ye)，用細(xi)胞(bao)計數法，計算每mL營養液(ye)中(zhong)的(de)細(xi)胞(bao)數，根據所計算的(de)細胞(bao)數，將原液(ye)稀釋成06個(ge)／mL。將稀釋好的細(xi)胞(bao)懸液(ye)接種到(dao)培養瓶(ping)中(zhong)，壹(yi)般(ban)200 mL培(pei)養瓶(ping)，放5—20 mL培(pei)養(yang)液(ye)，節約時(shi)可(ke)放lO mL培(pei)養(yang)液(ye)，培養(yang)液(ye)的量以覆蓋瓶(ping)底(di)為適中(zhong)。

⑧放入(ru)37℃、5％CO2溫箱培養：培養時(shi)，培(pei)養瓶(ping)的蓋不要(yao)擰得(de)太緊(jin)，以不會下(xia)掉為度(du)，以便(bian)CO2進(jin)入(ru)。培養(yang)～2 d後(hou)長(chang)成單(dan)層細胞(bao)，即可應(ying)用(yong)。

4)註(zhu)意事(shi)項(xiang)

①全部操作過程應(ying)在無(wu)菌條(tiao)件(jian)下(xia)完(wan)成(cheng)。

②故人(ren)5％CO2溫箱培養的目(mu)的是5％CO2能(neng)調節培養瓶(ping)中(zhong)的(de)pH，使(shi)之(zhi)在壹(yi)個(ge)星期(qi)或(huo)更長(chang)時(shi)間(jian)pH保持(chi)不(bu)變(bian)。