細胞(bao)懸(xuan)液的(de)制(zhi)備(bei)

(壹)實驗(yan)方法

．細胞(bao)懸(xuan)液的(de)制(zhi)備(bei) 將(jiang)生(sheng)長成(cheng)單(dan)層的(de)細胞(bao)，除去(qu)培養基，HBSS洗(xi)滌後(hou)，用(yong)0．02以(yi)EDTA或0．％溶(rong)液(無(wu)Ca 2+ 、Mg 2+之(zhi)磷酸緩(huan)沖(chong)液中(zhong))37℃消(xiao)化(hua)細胞(bao)。冉用(yong)HBSS浼(mei)滌次(ci)，加(jia)入適(shi)量(liang)生長用(yong)培(pei)養基，反(fan)復吹(chui)吸(xi)，制(zhi)成(cheng)單(dan)細胞(bao)懸(xuan)液，並(bing)計(ji)數(shu)。

2．UDS的放射自(zi)顯(xian)影(ying)顯(xian)示(shi)法

()將(jiang)單(dan)細胞(bao)懸(xuan)液接(jie)種(zhong)於置有小(xiao)蓋玻(bo)片(8mmX 6mm)的(de)培養瓶(ping)中。37℃培(pei)養～3d，使細胞(bao)在蓋玻(bo)片上(shang)生長至(zhi)適(shi)當(dang)密(mi)度(du)。

(2)改(gai)換同(tong)步(bu)化培(pei)養基(ADM補(bu)以(yi)％小(xiao)牛血(xue)清)作同(tong)步(bu)培養3--4d。

(3)在實(shi)驗(yan)前壹日下(xia)午(wu)，改(gai)換含(han)有0mmol／。(HU)的ADM培(pei)養基，37℃曩(nang)續孵(fu)育6h。

(4)將(jiang)上(shang)述(shu)長有細胞(bao)的蓋玻(bo)片置於(yu)含(han)有待檢(jian)樣(yang)品(pin)或已(yi)知致(zhi)癌物的同(tong)步(bu)用(yong)培(pei)養基(含(han)0mmmol／L HU及(ji)5～lOμci／ml，30Ci／mmol 3 H壹胸腺嘧(mi)啶(ding)核(he)苷)中(zhong)，37℃孵育5h。檢(jian)品(pin)及(ji)已(yi)知致(zhi)癌物溶液在(zai)實(shi)驗(yan)時新鮮(xian)配(pei)制(zhi)，以(yi)溶劑及(ji)已(yi)知致(zhi)癌物為對照(zhao)。

(5)孵(fu)育結束後(hou)，用(yong)HBSS充分(fen)洗(xi)滌，用(yong)％溶(rong)液處理0min，隨後(hou)用(yong)乙(yi)醇(chun)冰(bing)乙(yi)酸(3：)固定(ding)，4℃過(guo)夜。

(6)空氣(qi)中幹(gan)燥(zao)後(hou)，用(yong)少(shao)量中性(xing)樹膠(jiao)，將(jiang)蓋玻(bo)片粘(zhan)固於(yu)載玻(bo)片上(shang)，細胞(bao)面朝上(shang)，45℃烘烤24h。

(7)在(zai)暗室(shi)中，將(jiang)適(shi)量乳(ru)膠移(yi)入浸(jin)漬(zi)用(yong)玻(bo)璃器(qi)皿中(zhong)，置於(yu)40℃水(shui)浴(yu)中(zhong)令(ling)其(qi)融化(hua)，同(tong)時取等量(liang)蒸餾水(shui)於量(liang)筒(tong)中(zhong)也置於(yu)該(gai)水(shui)浴(yu)中(zhong)加(jia)熱，待(dai)乳(ru)膠融(rong)化後(hou)，將(jiang)熱(re)蒸餾水(shui)傾於(yu)乳(ru)膠液中(zhong)，繼(ji)續在(zai)水(shui)浴(yu)中(zhong)加(jia)溫，並(bing)用(yong)玻(bo)璃棒(bang)輕輕攪(jiao)拌(ban)，等(deng)待lO～20min，使氣泡(pao)逸(yi)出。在(zai)以(yi)上(shang)準備(bei)過(guo)程(cheng)中，將(jiang)待(dai)檢(jian)玻(bo)片置於(yu)水(shui)浴(yu)平(ping)臺(tai)上(shang)預熱(re)。準備(bei)就緒後，將(jiang)玻(bo)片垂直(zhi)浸漬(zi)於(yu)：稀釋(shi)的(de)乳(ru)膠液中(zhong)約(yue)5s，徐(xu)徐(xu)提(ti)出(chu)玻(bo)片，並(bing)用(yong)紗(sha)布或擦(ca)鏡(jing)紙拭(shi)去(qu)玻(bo)片背面乳(ru)膠。

(8)將(jiang)已(yi)塗(tu)有乳(ru)膠的(de)玻片移(yi)入溫度(du)為(wei)29℃及(ji)壹定(ding)濕(shi)度(du)的(de)溫箱(xiang)中(4h)待(dai)乳(ru)膠幹(gan)涸(he)。

(9)將(jiang)玻(bo)片置於(yu)內含適(shi)量幹(gan)燥(zao)劑(變色矽(gui)膠)的(de)曝(pu)光盒(he)中。曝(pu)光盒(he)外(wai)包以(yi)黑色避(bi)光(guang)紙及(ji)塑(su)料(liao)紙，置於(yu)4℃冰(bing)箱(xiang)中曝(pu)光0d。

(0)曝(pu)光結束後(hou)，將(jiang)玻(bo)片移(yi)人有機玻(bo)璃制(zhi)成(cheng)的(de)玻片架(jia)上(shang)，在液溫為(wei)9℃的D壹96顯(xian)影(ying)液中(zhong)顯(xian)影(ying)5min，在(zai)停(ting)顯(xian)液中(zhong)漂洗(xi)2min，在F壹5定(ding)影(ying)液中(zhong)定(ding)影(ying)6～lOmin，再(zai)用(yong)水(shui)漂洗(xi)數小(xiao)時。

()將(jiang)玻(bo)片脫(tuo)水(shui)透明(ming)後(hou)，用(yong)蓋玻(bo)片封(feng)固。

(2)在(zai)顯(xian)微(wei)鏡下(xia)，每(mei)個(ge)處理組(zu)計(ji)數各樣(yang)本細胞(bao)核(he)上(shang)的顯(xian)影(ying)銀(yin)粒(li)數，同(tong)時計數相(xiang)當面積(ji)的本(ben)底(di)銀(yin)粒數(shu)，並(bing)自(zi)核(he)上(shang)的銀(yin)粒(li)數減(jian)去(qu)。計數(shu)30～50個(ge)細胞(bao)核(he)。

3．LTDS的液體(ti)閃(shan)爍計(ji)數(shu)顯(xian)示(shi)法

()將(jiang)單(dan)細胞(bao)懸(xuan)液按(an)0．5×05個(ge)／ml濃度(du)接(jie)種(zhong)於液體(ti)閃(shan)爍計(ji)數(shu)瓶(ping)中，每(mei)瓶(ping)ml，並加(jia)入4C壹胸腺嘧(mi)啶(ding)核(he)苷終(zhong)濃度(du)為(wei)O．0μci／ml(50mCi／mmol)。37℃於(yu)細胞(bao)增殖(zhi)培(pei)養基中(zhong)培(pei)養48h使細胞(bao)增殖(zhi)並(bing)預標。

(2)去(qu)培養基並(bing)用(yong)HBSS洗(xi)滌後(hou)，換以(yi)含4c胸腺嘧(mi)啶(ding)核(he)苷(O．0μci／m)的(de)同(tong)步(bu)化培(pei)養基，37℃進行同(tong)步(bu)化培(pei)養2～4d。

(3)實驗(yan)前壹日下(xia)午(wu)去(qu)培(pei)養基，用(yong)HBSS充分(fen)洗(xi)滌後(hou)，加(jia)入含(han)有濃度(du)為(wei)0mm0／L羥基碌(lu)(HU)的(de)同(tong)步(bu)化培(pei)養基，37℃孵(fu)育6h。

(4)將(jiang)上(shang)述(shu)長有細胞(bao)的蓋玻(bo)片置於(yu)含(han)有Hu及(ji)3 H胸腺嘧(mi)啶(ding)核(he)苷(5μCi／ml，30Ci／mmol)的(de)同(tong)步(bu)化培(pei)養基中(zhong)，與不(bu)同(tong)濃度(du)的(de)檢(jian)品(pin)及(ji)已(yi)知致(zhi)癌物接觸5h。檢(jian)品(pin)及(ji)已(yi)知致(zhi)癌物溶液在(zai)實(shi)驗(yan)時新鮮(xian)配(pei)制(zhi)，以(yi)溶劑及(ji)已(yi)知致(zhi)癌物為對照(zhao)。

(5)孵(fu)育結束後(hou)，去(qu)培養基及(ji)檢(jian)品(pin)。冷(leng)鹽(yan)水(shui)洗滌2次(ci)，隨後(hou)用(yong)冰(bing)冷(leng)的(de)O．25mol／L過(guo)氯(lv)酸溶(rong)液處理2次(ci)，每(mei)次(ci)2min，以(yi)固定(ding)細胞(bao)並除(chu)去酸可(ke)溶(rong)性成(cheng)分(fen)。

(6)乙(yi)醇(chun)處理0min除(chu)去(qu)脂溶性成(cheng)分(fen)及(ji)未摻入的(de)標記(ji)物，幹(gan)後以(yi)O．5～lmol／L過氨酸0.5ml，於(yu)75～80℃恒(heng)溫箱(xiang)中水(shui)解(jie)40min，使摻人的標記(ji)物釋(shi)出(chu)。

(7)冷(leng)卻(que)後(hou)加(jia)入乙(yi)二(er)醇乙(yi)醚(mi)3．5ml及(ji)53ml閃(shan)爍液，振(zhen)搖(yao)後(hou)使呈勻(yun)相，以(yi)液體(ti)閃(shan)爍計(ji)數(shu)器(qi)測(ce)定(ding)各(ge)樣本(ben)中4c及(ji)3 H的(de)放(fang)射活性(xing)。標本(ben)中的3 H放(fang)射活性(xing)即(ji)反(fan)映UDS中(zhong)3 H壹胸腺嘧(mi)啶(ding)核(he)苷的(de)摻人量；而(er)4 c的放(fang)射活性(xing)反(fan)映實(shi)驗(yan)細胞(bao)的數(shu)目或其(qi)DNA量(liang)，因此(ci)3 H和(he)4c放射活性(xing)比(bi)(3 H/4 c)即為單(dan)位(wei)質(zhi)量DNA或單(dan)位(wei)數(shu)目細胞(bao)中UDS水(shui)平(ping)的(de)反(fan)映值(zhi)。

二(er)、結果判(pan)斷

    可用(yong)Student氏(shi)“t”檢(jian)驗(yan)檢(jian)測(ce)各檢(jian)品(pin)與溶劑對照(zhao)間(jian)有無(wu)顯(xian)著(zhu)性(xing)差異而(er)作(zuo)出判斷。

    試驗(yan)組處理的(de)細胞(bao)3 H壹胸腺嘧(mi)啶(ding)核(he)苷摻人數隨待(dai)檢(jian)樣(yang)品(pin)劑量增加(jia)而增(zeng)加(jia)，且有統計(ji)學(xue)意義(yi)，或者(zhe)zui小(xiao)劑量組反(fan)應陽性(xing)，與對照(zhao)組(zu)比(bi)較具(ju)有統計(ji)學(xue)意義(yi)，均(jun)可判定(ding)為(wei)該試驗(yan)陽性(xing)。受(shou)試物(wu)組(zu)處理的(de)細胞(bao)3H壹胸腺嘧(mi)啶(ding)核(he)苷摻人數不(bu)隨待(dai)檢(jian)樣(yang)品(pin)劑量增加(jia)而增(zeng)加(jia)，任何壹個(ge)劑量組與對照(zhao)組(zu)無(wu)統計(ji)學(xue)上(shang)的差異，則(ze)認為(wei)受(shou)試物(wu)在(zai)該試驗(yan)系統(tong)不(bu)引(yin)起UDS。判定(ding)結果時，應綜(zong)合考(kao)慮(lv)生(sheng)物(wu)學(xue)意義(yi)和(he)統計學(xue)意義(yi)。