溶血空斑形(xing)成試驗

    溶血空斑形(xing)成試驗(plaque forming cell assay)是體(ti)外檢(jian)測(ce)和計數B細胞(bao)功能的(de)壹(yi)種(zhong)常(chang)用方(fang)法(fa)，即(ji)檢(jian)測(ce)空斑形(xing)成細胞(bao)(plaque-formiilg cell，PFC)，反(fan)映(ying)B細胞(bao)產(chan)生(sheng)抗(kang)體(ti)的功能。當B細胞(bao)受(shou)抗原或(huo)有(you)絲分(fen)裂(lie)原刺激後，可分化(hua)增殖(zhi)為(wei)漿細胞(bao)，並分(fen)泌抗體(ti)。B細胞(bao)功能減(jian)弱(ruo)或(huo)缺陷(xian)，可表現(xian)為(wei)抗體(ti)形(xing)成細胞(bao)減少(shao)及(ji)血清(qing)Ig量(liang)的減(jian)少(shao)。PFC檢(jian)測(ce)方(fang)法(fa)很(hen)多(duo)，有(you)瓊(qiong)脂固相法、蓋(gai)玻片(pian)法、小室(shi)液相(xiang)法(fa)、單(dan)層(ceng)細胞(bao)法等。

.20%SRBC懸液(用Hank’s液配(pei)制(zhi))。

2．補(bu)體(ti)取3只(zhi)豚(tun)鼠的新(xin)鮮血清(qing)混合(he)，取壓(ya)積SRBC，按(an)SRBC與(yu)豚(tun)鼠血清(qing)：4～：6的(de)比例加(jia)入(ru)壓積SRBC，混勻，置4℃冰箱(xiang)30min，2000r／min離(li)心20min去除SRBC，以吸(xi)收(shou)豚(tun)鼠血清(qing)中(zhong)可能存(cun)在的抗(kang)SRBC抗體(ti)，防止假空斑的出現。

3．底(di)層(ceng)和頂層(ceng)瓊(qiong)脂取抗(kang)補體(ti)作用小的(de)瓊(qiong)脂，用PBS配(pei)成(cheng)．4％和O．7％兩種(zhong)濃(nong)度(du)。

4．DEAE右(you)旋(xuan)糖(tang)酐(gan)分(fen)子(zi)量(liang)50萬，用蒸(zheng)餾(liu)水(shui)配成％濃(nong)度(du)備用。

(三(san))方(fang)法(fa)

免(mian)疫(yi)脾(pi)細胞(bao)懸液的(de)制(zhi)備

．免疫(yi)小鼠：每(mei)只(zhi)小鼠經尾靜脈(mai)或(huo)腹(fu)腔註入(ru)上(shang)述(shu)SRB(：懸(xuan)液ml。

2．制(zhi)備脾(pi)細胞(bao)懸液：將(jiang)免(mian)疫(yi)後第(di)四天的(de)小鼠．拉頸(jing)處死，解(jie)剖取出(chu)脾(pi)臟(zang)，放人含Ca 2+ 、Mg 2+冷(leng)的(de)pH值7．2 PBS中(zhong)漂洗(xi)後(hou)，去掉(diao)結締(di)組(zu)織(zhi)，加(jia)入(ru)適(shi)量(liang)的PBS，用彎(wan)頭(tou)鑷子(zi)擠壓(ya)出脾(pi)細胞(bao)，稍(shao)靜(jing)置(zhi)，吸(xi)上(shang)清(qing)液至離(li)心(xin)管(guan)中(zhong)，500r／min離(li)心(xin)5min，棄(qi)上(shang)清(qing)液後(hou)，定量(liang)加(jia)入(ru)PBS，混勻，按(an)白(bai)細胞(bao)計數法計算脾(pi)細胞(bao)，zui後用PBS調(tiao)整(zheng)細胞(bao)數至07／ml的(de)濃(nong)度(du)。壹般(ban)每(mei)只(zhi)脾(pi)臟(zang)細胞(bao)數為～．5×08個。

3．傾(qing)註底(di)層(ceng)瓊(qiong)脂將．4％瓊(qiong)脂凝(ning)膠(jiao)經加(jia)熱融(rong)化後，傾(qing)註於水(shui)平(ping)位(wei)置(zhi)的(de)平(ping)皿內(nei)，每(mei)皿(min)2～3ml，凝(ning)固(gu)後，置37℃溫箱，平(ping)皿反(fan)扣(kou)，開(kai)蓋(gai)lh後備用。

4．頂層(ceng)瓊(qiong)脂的制(zhi)備將0．7％的瓊(qiong)脂融化後，置(zhi)於45℃恒(heng)溫水浴箱中(zhong)，依(yi)次(ci)加(jia)入(ru)：①2×09／ml SRBC懸液O． ml；②％DEAE有(you)旋(xuan)糖(tang)酐(gan)0．05ml；③07／ml脾(pi)細胞(bao)懸液O． ml。迅(xun)速(su)混勻後，傾(qing)註於已(yi)鋪好(hao)底(di)層(ceng)瓊(qiong)脂的平皿內(nei)，使(shi)之均(jun)勻鋪開(kai)，凝(ning)固(gu)後，靜置約5min，放37℃溫育～．5h。

5．加(jia)補體(ti)從(cong)溫箱中(zhong)取出(chu)平皿，每(mei)皿(min)加(jia)入(ru)：30稀釋(shi)的新(xin)鮮豚(tun)鼠血清(qing)．5ml(如(ru)未加(jia)DE—AE右(you)旋(xuan)糖(tang)酐(gan)，則加(jia)原血清(qing)或(huo)：5稀(xi)釋(shi)的新(xin)鮮血清(qing)．5ml)，繼(ji)續放37℃溫箱中(zhong)溫育30min後(hou)，取出(chu)，觀(guan)察溶血空斑。也可在室溫下放置(zhi)lh，4℃冰箱(xiang)過(guo)夜，翌日觀(guan)察結果(guo)。

(四(si))結果(guo)分(fen)析(xi)

    肉(rou)眼觀(guan)察可見空斑為邊緣整(zheng)齊(qi)的圓形(xing)透明(ming)區(qu)，如肉(rou)眼難(nan)以分辨(bian)，可在低倍(bei)鏡下鑒定，空斑的有(you)淋(lin)巴(ba)細胞(bao)，周(zhou)圍(wei)為透明(ming)區(qu)。壹個(ge)空斑代表壹個PFC，計(ji)數(shu)每(mei)塊玻(bo)片的(de)空斑數，算出每(mei)個(ge)脾(pi)臟(zang)中(zhong)PFC數(shu)。