紫外(wai)（UV）吸收測(ce)定法(fa)

實驗(yan)原(yuan)理

    蛋白質分(fen)子中所含和殘(can)基(ji)的(de)苯(ben)環含有共軛(e)雙(shuang)鍵，使(shi)蛋白質在(zai)280nm波(bo)長處(chu)有zui大吸(xi)收值(zhi)。在(zai)壹定(ding)濃(nong)度(du)範圍內，蛋白質溶(rong)液(ye)的(de)光(guang)吸(xi)收值(zhi)（A280）與其含量(liang)成正(zheng)比(bi)關系，可用(yong)作(zuo)定(ding)量測(ce)定。紫(zi)外(wai)線(xian)吸收法(fa)測定(ding)蛋白質含(han)量的(de)優(you)點(dian)是(shi)迅(xun)速，簡(jian)便(bian)，不消(xiao)耗樣品，低濃(nong)度(du)鹽(yan)類不幹擾(rao)測定。因此，廣(guang)泛應(ying)用(yong)在(zai)柱層(ceng)析(xi)分離(li)中(zhong)蛋白質洗(xi)脫(tuo)情況的(de)檢測。此法的(de)缺(que)點(dian)是(shi)：（）對(dui)於(yu)測(ce)定那(na)些與標(biao)準蛋白質中(zhong)和含(han)量(liang)差異(yi)較(jiao)大的(de)蛋白質，有(you)壹定(ding)的(de)誤差；（2）若(ruo)樣(yang)品中(zhong)核(he)酸(suan)等吸收紫(zi)外線(xian)的物質，會(hui)出(chu)現較(jiao)大的(de)幹擾(rao)。不同的(de)蛋白質和(he)核(he)酸(suan)的紫外(wai)線吸(xi)收是(shi)不同的(de)，即(ji)使(shi)經(jing)過(guo)校正(zheng)，測(ce)定結果(guo)也(ye)還(hai)存(cun)在(zai)壹定(ding)的(de)誤差。但(dan)是(shi)可(ke)作(zuo)為(wei)初步(bu)定量的(de)依據。該法(fa)可測定(ding)蛋白範圍應在(zai)0.~.0mg /mL。ELISA試(shi)劑(ji)盒(he)

試(shi)劑(ji)和器(qi)材

壹、標(biao)準和(he)待(dai)測(ce)蛋白質溶(rong)液(ye)

.標(biao)準蛋白溶(rong)液(ye)

    結晶(jing)牛血(xue)清蛋白，預(yu)先(xian)經微(wei)量(liang)凱(kai)氏(shi)定氮法測定(ding)蛋白氮含量，根據其純(chun)度(du)配(pei)制成(cheng)mg/mL蛋白溶(rong)液(ye)。

2. 待(dai)測(ce)蛋白質溶(rong)液(ye)

    人(ren)血清(qing)，使(shi)用(yong)前稀(xi)釋00倍(bei)。ELISA試(shi)劑(ji)盒(he)

二(er)、器材

    試(shi)管.5×5cm（×9），試(shi)管架，移(yi)液(ye)管mL（×3）；2mL（×2）；5mL（×2）；分光(guang)光(guang)度(du)計(ji)。

操(cao)作(zuo)方(fang)法(fa)

壹、制作(zuo)標(biao)準曲(qu)線

    取(qu)8支(zhi)試(shi)管編號(hao)，按下表(biao)分(fen)別向每支(zhi)試(shi)管加入(ru)各(ge)種(zhong)試(shi)劑(ji)，搖勻(yun)。選用(yong)光(guang)程(cheng)為(wei)cm的石(shi)英(ying)比色(se)杯，在(zai)280nm波(bo)長處(chu)分別測(ce)定(ding)各(ge)管溶(rong)液(ye)的(de)A280值(zhi)。以(yi)A280值(zhi)為(wei)縱坐標(biao)，蛋白質濃(nong)度(du)為(wei)橫坐標(biao)，繪制標(biao)準曲(qu)線。

二(er)、樣品(pin)測(ce)定(ding)

    取(qu)待(dai)測(ce)蛋白質溶(rong)液(ye)mL，加(jia)入(ru)蒸(zheng)餾(liu)水(shui)3mL，搖勻，按上(shang)述方(fang)法(fa)在(zai)280nm波(bo)長處(chu)測定光(guang)吸(xi)收值(zhi)，並(bing)從標(biao)準曲(qu)線上(shang)查出(chu)待(dai)測(ce)蛋白質的(de)濃(nong)度(du)。

註意事(shi)項

    由於(yu)各(ge)種(zhong)蛋白質含(han)有不同量(liang)的(de)和(he)苯(ben)，顯(xian)色的(de)深淺往往(wang)隨不同的(de)蛋白質而(er)變化(hua)。因而本測定(ding)法(fa)通常(chang)只(zhi)適(shi)用(yong)於(yu)測(ce)定(ding)蛋白質的(de)相(xiang)對濃(nong)度(du)（相(xiang)對於(yu)標(biao)準蛋白質）。此(ci)外蛋白溶(rong)液(ye)中(zhong)存(cun)在(zai)核(he)酸(suan)或核(he)苷酸(suan)時也(ye)會影(ying)響紫外(wai)吸(xi)收法(fa)測定(ding)蛋白質含(han)量的(de)準(zhun)確性。ELISA試(shi)劑(ji)盒(he)