ELISA試(shi)劑盒定(ding)性測定的顯(xian)色(se)與說(shuo)明書

    .  血(xue)清：使用(yong)不含(han)熱原(yuan)和(he)內毒素(su)的試(shi)管，操作過程(cheng)中避(bi)免任何細胞刺(ci)激(ji)，收(shou)集血(xue)液後，3000轉離(li)心(xin)0分鐘(zhong)將血(xue)清和紅細(xi)胞迅(xun)速小心地分離(li)。ELISA試(shi)劑盒

2.  血(xue)漿(jiang)：EDTA、檸檬酸鹽(yan)或(huo)肝(gan)素(su)抗凝。3000轉離(li)心(xin)30分鐘(zhong)取上清。

3.  細胞(bao)上(shang)清(qing)液：3000轉離(li)心(xin)0分鐘(zhong)去(qu)除顆粒(li)和聚合物(wu)。

4.  組(zu)織勻漿(jiang)：將組織加入適量(liang)生理(li)鹽(yan)水(shui)搗碎(sui)。3000轉離(li)心(xin)0分鐘(zhong)取上清。

5.  保(bao)存：如(ru)果(guo)樣本收集(ji)後不及時檢測，請按(an)壹次(ci)用(yong)量分裝(zhuang)，凍(dong)存於-20℃，避免反復凍(dong)融，在(zai)室溫(wen)下(xia)解凍(dong)並確保(bao)樣品均(jun)勻地充(chong)分解(jie)凍(dong)。

小鼠(shu)c-Jun氨(an)基(ji)末(mo)端激(ji)酶(mei)（JNK）操作步(bu)驟

  從(cong)室溫(wen)平衡20min後的鋁箔袋(dai)中取出所需板條(tiao)，剩(sheng)余板(ban)條(tiao)用(yong)自(zi)封袋(dai)密封(feng)放(fang)回(hui)4℃。
  設置(zhi)標(biao)準品孔(kong)和樣(yang)本孔(kong)，標(biao)準品孔(kong)各加不同濃度的標(biao)準品50μL；
  樣(yang)本孔(kong)先加待測樣本(ben)0μL，再(zai)加樣本稀(xi)釋液(ye)40μL；空(kong)白(bai)孔不加。
  除空(kong)白(bai)孔外(wai)，標(biao)準品孔(kong)和樣(yang)本孔(kong)中每孔加入辣根(gen)過氧(yang)化(hua)物(wu)酶(mei)（HRP）標(biao)記(ji)的檢(jian)測抗體(ti)00μL，用(yong)封板膜(mo)封(feng)住反應(ying)孔(kong)，37℃水(shui)浴鍋(guo)或(huo)恒(heng)溫(wen)箱(xiang)溫(wen)育60min。
  棄去(qu)液(ye)體(ti)，吸水(shui)紙上拍幹，每孔加滿洗滌液，靜(jing)置(zhi)min，甩(shuai)去(qu)洗滌液，吸水(shui)紙上拍幹，如此(ci)重復洗板5次(ci)（也(ye)可(ke)用(yong)洗板機(ji)洗板）。
  每孔加入底(di)物(wu)A、B各(ge)50μL，37℃避光(guang)孵(fu)育5min。
  每孔加入終止液50μL，5min內，在(zai)450nm波(bo)長處(chu)測定各(ge)孔(kong)的OD值。

結果(guo)判(pan)斷

 繪(hui)制(zhi)標(biao)準曲線：在(zai)Excel工(gong)作(zuo)表(biao)中，以(yi)標(biao)準品濃度作橫(heng)坐標(biao)，對(dui)應(ying)OD值作縱坐(zuo)標(biao)，繪(hui)制(zhi)出標(biao)準品線性回(hui)歸(gui)曲線，按(an)曲線方(fang)程(cheng)計(ji)算(suan)各樣(yang)本(ben)濃度值。ELISA試(shi)劑盒

此(ci)時酶催(cui)化(hua)無色(se)的底(di)物(wu)生成(cheng)有(you)色(se)的產(chan)物(wu)。反應(ying)的溫(wen)度和時(shi)間仍(reng)是影(ying)響顯(xian)色(se)的因(yin)素(su)。在(zai)壹定時(shi)間內，陰(yin)性孔可保(bao)持(chi)無色(se)，而(er)陽性孔則隨(sui)時(shi)間的延(yan)長而(er)呈色(se)加強(qiang)。適當提(ti)高溫(wen)度有(you)助於加速顯色(se)進行(xing)。在(zai)定(ding)量(liang)測定中，加入底(di)物(wu)後的反應(ying)溫(wen)度和時(shi)間應(ying)按(an)規(gui)定力(li)求(qiu)準確(que)。ELISA試(shi)劑盒時(shi)間壹般不需要嚴格控(kong)制，有(you)時可(ke)根(gen)據陽性對(dui)照孔和陰(yin)性對(dui)照孔的顯(xian)色(se)情況適當縮(suo)短或延(yan)長反應(ying)時(shi)間，及時判(pan)斷。
OPD底(di)物(wu)顯(xian)色(se)壹般在(zai)室外(wai)溫(wen)或(huo)37 ℃反應(ying)20-30分鐘(zhong)後即(ji)不再(zai)加深(shen)，再(zai)延(yan)長反應(ying)時(shi)間，可(ke)使(shi)本底(di)值增(zeng)高。OPD底(di)物(wu)液(ye)受光照會自(zi)行變色(se)，顯色(se)反應(ying)應(ying)避(bi)光(guang)進(jin)行，顯色(se)反應(ying)結束(shu)時加入終止液終(zhong)止反應(ying)。OPD產(chan)物(wu)用(yong)硫酸終(zhong)止後，顯(xian)色(se)由(you)橙(cheng)黃色(se)轉向(xiang)棕黃色(se)。
    TMB受光照的影(ying)響不大，ELISA試(shi)劑盒可(ke)在(zai)室溫(wen)中置(zhi)於操作臺上，邊反應(ying)觀察結果(guo)。但(dan)為(wei)保(bao)證實(shi)驗結果(guo)的穩(wen)定(ding)性，宜(yi)在(zai)規(gui)定的適(shi)當時間閱(yue)讀結果(guo)。TMB經HRP作用(yong)後，約(yue)40分鐘(zhong)顯(xian)色(se)達，隨(sui)即(ji)逐(zhu)漸減弱，至2小時後即(ji)可(ke)*消退(tui)至無色(se)。TMB的終(zhong)止液有(you)多種(zhong)，疊(die)氮鈉和(he)十(shi)二烷基(ji)硫酸鈉(na)（SDS）等酶(mei)抑(yi)制劑均(jun)可(ke)使(shi)反應(ying)終(zhong)止。這類(lei)終(zhong)止劑尚(shang)能使(shi)藍(lan)色(se)維(wei)持(chi)較(jiao)長時(shi)間（2-24小時）不褪(tui)，是目(mu)視(shi)判(pan)斷的良好(hao)終止劑。此(ci)外(wai)，各類酸性終止液則(ze)會使藍色(se)轉變(bian)成(cheng)黃色(se)，此時(shi)可用(yong)特定的波(bo)長（450 nm）測讀吸光(guang)值。
（2）比(bi)色(se)
    比(bi)色(se)前應(ying)先(xian)用(yong)潔凈(jing)的吸水(shui)紙拭幹板底(di)附(fu)著的液(ye)體(ti)，ELISA試(shi)劑盒然(ran)後將板正(zheng)確(que)放(fang)入酶標(biao)比(bi)色(se)儀(yi)的比(bi)色(se)架中。以(yi)軟板為(wei)載體(ti)的試(shi)驗，需先將板置(zhi)於標(biao)準96孔(kong)的座(zuo)架(jia)中，才(cai)可(ke)進行(xing)比(bi)色(se)。在(zai)加底(di)物(wu)液(ye)顯色(se)前，先(xian)將軟板(ban)邊(bian)緣(yuan)剪凈(jing)，這樣(yang)，此(ci)板(ban)就(jiu)可*平妥坐(zuo)入座架(jia)中。ELISA試(shi)劑盒