豬急性腎(shen)損(sun)傷(shang)（NGAL）ELISA試劑(ji)盒(he)操作指南

豬急性腎(shen)損(sun)傷(shang)(NGAL)ELISA試劑(ji)盒(he)操作指南

本(ben)試劑(ji)僅供(gong)研究使用       目的：本(ben)試劑(ji)盒(he)用於測(ce)定豬(zhu)血清，血(xue)漿(jiang)及相(xiang)關液(ye)體樣(yang)本(ben)中急性腎(shen)損(sun)傷(shang)(NGAL)的(de)含量(liang)。

實驗原(yuan)理(li)：

   本(ben)試劑(ji)盒(he)應用雙抗(kang)體夾(jia)心(xin)法(fa)測(ce)定標(biao)本(ben)中豬急性腎(shen)損(sun)傷(shang)(NGAL)水(shui)平。用純化(hua)的(de)豬急性腎(shen)損(sun)傷(shang)(NGAL)抗(kang)體包被微孔板，制成(cheng)固相抗(kang)體，往包(bao)被單抗(kang)的微孔中依次加(jia)入急性腎(shen)損(sun)傷(shang)(NGAL)，再(zai)與(yu)HRP標(biao)記(ji)的(de)急性腎(shen)損(sun)傷(shang)(NGAL)抗(kang)體結(jie)合(he)，形(xing)成(cheng)抗(kang)體-抗(kang)原-酶標抗(kang)體復合(he)物(wu)，經(jing)過(guo)*洗滌後加(jia)底(di)物TMB顯(xian)色(se)。TMB在HRP酶的(de)催(cui)化(hua)下(xia)轉化(hua)成(cheng)藍色(se)，並在(zai)酸(suan)的(de)作用(yong)下(xia)轉化(hua)成(cheng)zui終的黃色。顏(yan)色的深(shen)淺(qian)和(he)樣(yang)品中的急性腎(shen)損(sun)傷(shang)(NGAL)呈(cheng)正相(xiang)關。用(yong)酶標儀(yi)在(zai)450nm波長(chang)下(xia)測(ce)定吸(xi)光(guang)度（OD值），通(tong)過(guo)標準(zhun)曲線計(ji)算(suan)樣(yang)品中豬急性腎(shen)損(sun)傷(shang)(NGAL)濃(nong)度。

豬急性腎(shen)損(sun)傷(shang)(NGAL)ELISA試劑(ji)盒(he)組(zu)成(cheng)：

試劑(ji)盒(he)組(zu)成(cheng)

48孔配(pei)置(zhi)

96孔配(pei)置(zhi)

保存

操(cao)作(zuo)指(zhi)南

份(fen)

份(fen)

封板膜

2片（48）

2片（96）

密封(feng)袋(dai)

個

個

酶(mei)標包(bao)被板

×48

×96

2-8℃保存

標(biao)準(zhun)品：35ng/ml

0.5ml×瓶

0.5ml×瓶

2-8℃保存

標(biao)準(zhun)品稀釋(shi)液

.5ml×瓶

.5ml×瓶

2-8℃保存

酶(mei)標(biao)試劑(ji)

3 ml×瓶

6 ml×瓶

2-8℃保存

樣(yang)品稀釋(shi)液

3 ml×瓶

6 ml×瓶

2-8℃保存

顯(xian)色(se)劑(ji)A液(ye)

3 ml×瓶

6 ml×瓶

2-8℃保存

顯(xian)色(se)劑(ji)B液(ye)

3 ml×瓶

6 ml×瓶

2-8℃保存

終止液

3ml×瓶

6ml×瓶

2-8℃保存

濃(nong)縮洗滌液

（20ml×20倍(bei)）×瓶

（20ml×30倍）×瓶

2-8℃保存

豬(zhu)急性腎(shen)損(sun)傷(shang)(NGAL)ELISA試劑(ji)盒(he)樣(yang)本(ben)處理(li)及要(yao)求(qiu)：

. 血清：室(shi)溫(wen)血(xue)液自(zi)然(ran)凝(ning)固0-20分鐘(zhong)，離心(xin)20分(fen)鐘(zhong)左(zuo)右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過(guo)程中如(ru)出現(xian)沈(chen)澱，應再次離(li)心(xin)。

2. 細胞培(pei)養上清：檢(jian)測(ce)分泌(mi)性的(de)成(cheng)份(fen)時，用(yong)無(wu)菌(jun)管收(shou)集。離心(xin)20分(fen)鐘左(zuo)右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢(jian)測(ce)細胞內的成(cheng)份(fen)時，用(yong)PBS（PH7.2-7.4）稀釋(shi)細胞懸(xuan)液，細胞濃(nong)度達到(dao)00萬/ml左(zuo)右。通過(guo)反復凍(dong)融(rong)，以(yi)使細胞破(po)壞(huai)並放(fang)出細胞內成(cheng)份(fen)。離心20分(fen)鐘左(zuo)右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過(guo)程中如(ru)有(you)沈澱形成(cheng)，應再(zai)次(ci)離(li)心。

3. 組(zu)織(zhi)標本(ben)：切(qie)割(ge)標(biao)本(ben)後，稱取(qu)重(zhong)量(liang)。加入壹(yi)定(ding)量(liang)的PBS，PH7.4。用液(ye)氮(dan)迅速(su)冷凍保存備用。標(biao)本(ben)融化(hua)後仍(reng)然(ran)保持2-8℃的(de)溫(wen)度。加入壹(yi)定(ding)量(liang)的PBS（PH7.4），用手(shou)工(gong)或勻漿(jiang)器將標本(ben)勻漿(jiang)充分(fen)。離(li)心20分(fen)鐘(zhong)左(zuo)右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分(fen)裝後壹(yi)份(fen)待檢測(ce)，其余冷凍備用。

4. 標(biao)本(ben)采集後盡早進行(xing)提取(qu)，提取(qu)按(an)相關文獻進行(xing)，提取(qu)後應(ying)盡快(kuai)進行(xing)實驗。若不(bu)能馬上進行(xing)試驗，可將標本(ben)放於-20℃保存，但(dan)應避(bi)免反復凍(dong)融(rong).

5. 血漿(jiang)：應(ying)根(gen)據(ju)標(biao)本(ben)的要(yao)求(qiu)選擇(ze)EDTA或檸(ning)檬酸(suan)鈉(na)作為(wei)抗(kang)凝(ning)劑(ji)，混合(he)0-20分(fen)鐘(zhong)後，離(li)心(xin)20分鐘左(zuo)右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過(guo)程中如(ru)有(you)沈澱形成(cheng)，應該(gai)再(zai)次(ci)離心。

6. 尿(niao)液：用(yong)無(wu)菌(jun)管收(shou)集，離心(xin)20分(fen)鐘左(zuo)右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過(guo)程中如(ru)有(you)沈澱形成(cheng)，應再(zai)次(ci)離(li)心。胸(xiong)腹水(shui)、腦脊(ji)液(ye)參(can)照實行(xing)。

7. 不能檢測(ce)含NaN3的(de)樣(yang)品，因NaN3抑制辣(la)根(gen)過(guo)氧化(hua)物(wu)酶的（HRP）活(huo)性。

豬急性腎(shen)損(sun)傷(shang)(NGAL)ELISA試劑(ji)盒(he)操作步(bu)驟

標(biao)準(zhun)品的稀(xi)釋與(yu)加(jia)樣(yang)：在酶標(biao)包(bao)被板上設(she)標(biao)準品孔0孔，在*、第(di)二(er)孔中分別(bie)加標(biao)準(zhun)品00μl，然(ran)後在(zai)*、第(di)二(er)孔中加標(biao)準品稀釋(shi)液50μl，混勻；然(ran)後從*孔、第二(er)孔中各(ge)取00μl分(fen)別(bie)加(jia)到第三(san)孔和第(di)四(si)孔，再在(zai)第(di)三(san)、第四(si)孔分別(bie)加(jia)標準品稀釋(shi)液50μl，混勻；然(ran)後在(zai)第(di)三(san)孔和第(di)四(si)孔中先各(ge)取50μl棄(qi)掉(diao)，再(zai)各(ge)取50μl分(fen)別(bie)加(jia)到第五(wu)、第(di)六(liu)孔中，再在(zai)第五(wu)、第(di)六(liu)孔中分別(bie)加標(biao)準(zhun)品稀釋(shi)液50ul，混勻；混勻後從第(di)五(wu)、第(di)六(liu)孔中各(ge)取50μl分(fen)別(bie)加(jia)到第七(qi)、第(di)八(ba)孔中，再在(zai)第七(qi)、第(di)八(ba)孔中分別(bie)加標(biao)準(zhun)品稀釋(shi)液50μl，混勻後從第(di)七(qi)、第(di)八(ba)孔中分別(bie)取50μl加(jia)到(dao)第(di)九、第(di)十(shi)孔中，再在(zai)第九第(di)十(shi)孔分別(bie)加(jia)標準品稀釋(shi)液50μl，混勻後從第(di)九第(di)十(shi)孔中各(ge)取50μl棄(qi)掉(diao)。（稀(xi)釋(shi)後各(ge)孔加樣(yang)量(liang)都為(wei)50μl，濃(nong)度分別(bie)為(wei)90 ng/ml，60 ng/ml ，30 ng/ml，5 ng/ml， 7.5 ng/ml）。
加(jia)樣(yang)：分別設(she)空白(bai)孔（空白(bai)對(dui)照孔不加(jia)樣(yang)品及酶(mei)標(biao)試劑(ji)，其余各(ge)步(bu)操(cao)作相同）、待(dai)測(ce)樣(yang)品孔。在酶(mei)標(biao)包被板上待(dai)測(ce)樣(yang)品孔中先加樣(yang)品稀釋(shi)液40μl，然(ran)後再(zai)加(jia)待測(ce)樣(yang)品0μl（樣(yang)品zui終稀釋度為(wei)5倍(bei)）。加(jia)樣(yang)將樣(yang)品加於酶(mei)標板孔底(di)部，盡量(liang)不觸及孔壁，輕(qing)輕(qing)晃動混勻。
溫(wen)育(yu)：用封板膜封(feng)板後置(zhi)37℃溫(wen)育(yu)30分鐘。
配(pei)液(ye)：將30（48T的20倍(bei)）倍(bei)濃(nong)縮洗滌液用(yong)蒸(zheng)餾水30（48T的(de)20倍）倍(bei)稀(xi)釋(shi)後備用。
洗滌：小心(xin)揭掉(diao)封(feng)板膜，棄(qi)去(qu)液體，甩幹(gan)，每(mei)孔加滿洗滌液，靜(jing)置(zhi)30秒(miao)後棄(qi)去(qu)，如(ru)此重復5次(ci)，拍幹(gan)。
加(jia)酶：每(mei)孔加入酶(mei)標(biao)試劑(ji)50μl，空白(bai)孔除(chu)外(wai)。
溫(wen)育(yu)：操作同(tong)3。
洗滌：操作(zuo)同(tong)5。
顯(xian)色(se)：每(mei)孔先加入顯(xian)色(se)劑(ji)A50μl，再(zai)加入顯(xian)色(se)劑(ji)B50μl，輕(qing)輕震蕩(dang)混勻，37℃避(bi)光(guang)顯(xian)色(se)5分鐘.
終止：每(mei)孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色(se)立轉黃色）。
測(ce)定：以(yi)空白(bai)空調(tiao)零(ling)，450nm波(bo)長(chang)依序測(ce)量(liang)各(ge)孔的吸(xi)光(guang)度（OD值）。 測(ce)定應(ying)在加(jia)終止液後5分(fen)鐘(zhong)以(yi)內進行(xing)。

註意事項(xiang)：

試劑(ji)盒(he)從冷藏(zang)環境(jing)中取出應在(zai)室(shi)溫(wen)平衡5-30分鐘(zhong)後方(fang)可使用，酶標包被板開封(feng)後如(ru)未(wei)用(yong)完(wan)，板條應(ying)裝入密封(feng)袋(dai)中保存。
濃(nong)洗滌液可能會有(you)結(jie)晶(jing)析(xi)出，稀釋(shi)時可在(zai)水浴(yu)中加溫(wen)助(zhu)溶，洗滌時不(bu)影響(xiang)結(jie)果(guo)。
各(ge)步(bu)加(jia)樣(yang)均(jun)應使用加樣(yang)器，並經(jing)常(chang)校對其準確(que)性，以(yi)避(bi)免試驗誤差。壹次(ci)加樣(yang)時間(jian)控(kong)制在(zai)5分(fen)鐘內，如(ru)標(biao)本(ben)數量(liang)多(duo)，使用排槍(qiang)加(jia)樣(yang)。
請每(mei)次(ci)測(ce)定的(de)同時做(zuo)標準(zhun)曲(qu)線(xian)，做復孔。如(ru)標(biao)本(ben)中待測(ce)物質(zhi)含量(liang)過(guo)高（樣(yang)本(ben)OD值大於標(biao)準品孔*孔的OD值(zhi)），請先用樣(yang)品稀釋(shi)液稀(xi)釋(shi)壹(yi)定(ding)倍數（n倍）後再(zai)測(ce)定，計(ji)算(suan)時請zui後乘(cheng)以(yi)總(zong)稀釋(shi)倍(bei)數(shu)（×n×5）。
封板膜只(zhi)限壹次性(xing)使用，以(yi)避(bi)免交叉汙(wu)染。
底(di)物請避(bi)光(guang)保存。
嚴格按(an)照說(shuo)明(ming)書(shu)的(de)操(cao)作進行(xing)，試驗結(jie)果(guo)判定(ding)必須以(yi)酶標(biao)儀讀數(shu)為(wei)準(zhun).
所(suo)有(you)樣(yang)品，洗滌液和(he)各(ge)種廢(fei)棄(qi)物(wu)都(dou)應按(an)傳染物(wu)處(chu)理(li)。
本(ben)試劑(ji)不(bu)同批號(hao)組(zu)分(fen)不得(de)混用。

8. 如(ru)與(yu)英(ying)文說明(ming)書(shu)有(you)異，以(yi)英(ying)文說明(ming)書(shu)為(wei)準(zhun)。

[文本(ben)框:] 計(ji)算(suan)：

以(yi)標準(zhun)物的濃(nong)度為(wei)橫(heng)坐(zuo)標(biao)，OD值為(wei)縱(zong)坐(zuo)標(biao)，   

在坐(zuo)標(biao)紙(zhi)上繪(hui)出標準(zhun)曲(qu)線(xian)，根(gen)據樣(yang)品的OD     

值(zhi)由(you)標(biao)準曲線查(zha)出相應(ying)的(de)濃(nong)度；再乘(cheng)以(yi)稀釋(shi)     

倍數；或用(yong)標準物(wu)的濃(nong)度與(yu)OD值(zhi)計(ji)算(suan)出標     

準(zhun)曲(qu)線(xian)的(de)直(zhi)線回(hui)歸方程式，將樣(yang)品的OD值(zhi)     

代入方(fang)程(cheng)式，計(ji)算(suan)出樣(yang)品濃(nong)度，再乘(cheng)以(yi)稀釋(shi)     

倍數，即為(wei)樣(yang)品的實際(ji)濃(nong)度。