改(gai)良(liang)過(guo)碘酸鈉(na)標記(ji)法(fa)制(zhi)備(bei)酶標抗體(ti)

HRP分(fen)子(zi)中(zhong)與(yu)酶活性無(wu)關(guan)的糖基(ji)被(bei)過碘酸鈉(na)氧(yang)化為(wei)醛(quan)基(ji)，再(zai)與(yu)抗體(ti)蛋(dan)白(bai)的氨基(ji)形成(cheng)Schiff堿。為(wei)了防(fang)止酶蛋(dan)白(bai)的氨基(ji)與(yu)醛(quan)基(ji)發生自(zi)身(shen)偶聯，在(zai)標記(ji)前(qian)先用2，4-二(er)硝(xiao)基(ji)氟苯（DNFB）封閉(bi)酶蛋(dan)白(bai)中(zhong)殘(can)留(liu)的a-和e-氨基(ji)。酶與(yu)抗體(ti)的結(jie)合反(fan)應(ying)後(hou)，再(zai)加入(ru)硼氫化鈉(na)還原(yuan)成穩(wen)定的結(jie)合物(wu)。

（） 取(qu)HRP 5mg溶於0.2mol/L，pH5.6醋(cu)酸鹽(yan)緩沖液(ye)ml中(zhong)，加入(ru)%DNFB無(wu)水(shui)乙(yi)醇(chun)溶液(ye)0.ml，室溫下輕微攪拌(ban)h；
（2） 加入(ru)新(xin)鮮(xian)配(pei)置的0.mol/L NaIO4 0.5ml，此(ci)時(shi)溶液(ye)由原(yuan)棕色(se)變(bian)為墨綠(lv)色，置(zhi)4℃放置30min，此時(shi)溶液(ye)由原(yuan)棕色(se)變(bian)為墨綠(lv)色；
（3） 加入(ru)2.5%乙(yi)二(er)醇(chun)ml， 室(shi)溫下輕微攪拌(ban)h，終止(zhi)反(fan)應(ying)；
（4） 加入(ru)待(dai)標記(ji)的抗體(ti)5-0mg， 用.0mol/L， pH9.5 CBS，調節pH值(zhi)至9.0；
（5） 混勻(yun)，置4℃過夜(ye)改(gai)良(liang)過(guo)碘酸鈉(na)標記(ji)法(fa)制(zhi)備(bei)酶標抗體(ti)
（6） 加入(ru)硼氫化鈉(na)溶液(ye)0.ml，混勻(yun)，4℃放置3h；
（7） 對0.0mol/L，pH7.4 PBS，4℃透析過(guo)夜(ye)，換(huan)液(ye)3次(ci)；
（8） 3000r/min離(li)心30min，去(qu)除(chu)沈(chen)澱物(wu)；
（9） 收集上清液(ye)即為(wei)酶標記(ji)抗體(ti)。

【註意事項(xiang)】
（） 在(zai)氧(yang)化HRP時(shi)，以(yi)pH5.6醋酸鹽(yan)緩沖液(ye)溶解酶為宜。
（2） 壹(yi)般(ban)認(ren)為(wei)氧(yang)化HRP 5mg， NaIO4量(liang)以0.06mol/L 0.5ml為宜，不(bu)能(neng)低(di)於0.05mol/L 0.5ml。
（3） 氧(yang)化HRP時(shi)間(jian)以5-30min為宜。
（4） 加入(ru)DNFB的目(mu)的是(shi)為了封閉(bi)酶蛋(dan)白(bai)中(zhong)殘(can)留(liu)的a-和e-氨基(ji)。
（5） 加入(ru)乙(yi)二(er)醇(chun)的目(mu)的是(shi)終止(zhi)反(fan)應(ying)；為便於在(zai)加入(ru)抗體(ti)後(hou)調pH值(zhi)，故乙(yi)二(er)醇(chun)要(yao)用0.05mol/L CBS配(pei)制。
改(gai)良(liang)過(guo)碘酸鈉(na)標記(ji)法(fa)制(zhi)備(bei)酶標抗體(ti)