細(xi)胞(bao)雕(diao)亡檢測操作(zuo)步驟之(zhi)ELISA法

細(xi)胞(bao)雕(diao)亡發生時(shi)，內源性(xing)核(he)酸內切酶(mei)將分(fen)解核(he)小(xiao)體(ti)區(qu)間(jian)的(de)雙鏈(lian)DNA，但核(he)小(xiao)體(ti)本身由於由組(zu)蛋(dan)白(bai)緊(jin)密結合而免受(shou)切(qie)割(ge)，單克(ke)隆抗(kang)體(ti)可以(yi)與(yu)核(he)小(xiao)體(ti)形成(cheng)夾(jia)心結構(gou)，可通(tong)過(guo)檢測核(he)小(xiao)體(ti)判(pan)斷細胞(bao)是(shi)否(fou)經(jing)歷(li)雕(diao)亡事件。
(壹(yi)) 原(yuan)理(li)
細胞(bao)雕(diao)亡的(de)發(fa)生，是(shi)由於鈣(gai)-鎂依(yi)賴(lai)性(xing)核(he)酸酶(mei)進(jin)入(ru)核(he)小(xiao)體(ti)間切割(ge)DNA,產生(sheng)80bp～200bp或(huo)其(qi)倍(bei)數的(de)核(he)小(xiao)體(ti)片段。而(er)核(he)小(xiao)體(ti)由於與(yu)組蛋(dan)白(bai)H2A、H2B、H3和(he)H4形成(cheng)緊(jin)密復合物(wu)而不(bu)被核(he)酸內切酶(mei)切(qie)割(ge)。采用雙抗(kang)體(ti)夾(jia)心酶(mei)免疫法，應(ying)用小(xiao)鼠抗(kang)DNA和(he)抗(kang)組(zu)蛋(dan)白(bai)的(de)單(dan)克隆抗(kang)體(ti)，與核(he)小(xiao)體(ti)片段形成(cheng)夾(jia)心結構(gou)，可特(te)異性檢測細胞(bao)溶(rong)解物(wu)中的(de)核(he)小(xiao)體(ti)片段。
(二(er))材料(liao)與試(shi)劑(ji)
.采(cai)用Boehringer Mannheim公(gong)司(si)試(shi)劑(ji)盒(he)，生物(wu)標記(ji)的(de)小(xiao)鼠抗(kang)組(zu)蛋(dan)白(bai)單(dan)克(ke)隆抗(kang)
體(ti)。
2.過(guo)氧化物(wu)酶(-POD)標(biao)記(ji)的(de)小(xiao)鼠抗(kang)DNA單(dan)克(ke)隆抗(kang)體(ti)
3.鏈黴(mei)親(qin)合素包被(bei)的(de)微孔板(ban)
4.DNA-組(zu)蛋(dan)白(bai)復(fu)合物(wu)，作(zuo)為陰(yin)性對照。
5.ABTS底(di)物(wu)
6.溶(rong)解緩沖液
7.溫育緩沖液
8.底(di)物(wu)緩沖液
(三(san))樣品
.培養細(xi)胞(bao)或離(li)體(ti)細胞(bao)的(de)裂(lie)解物(wu)細胞(bao)裂(lie)解步驟：收集(ji)細(xi)胞(bao)，離(li)心後，用200µl溶(rong)細胞(bao)緩沖液重新(xin)懸浮(fu)，室(shi)溫下(xia)作(zuo)用30min。
2.培養細(xi)胞(bao)的(de)上(shang)清液(ye)
3.血漿(jiang)(血清(qing))