胸(xiong)膜肺(fei)炎放線(xian)桿菌(jun)PCR檢測(ce)試劑盒產品(pin)實(shi)驗(yan)的反(fan)應(ying)五(wu)要(yao)素(su)

胸(xiong)膜肺(fei)炎放線(xian)桿菌(jun)PCR檢測(ce)試劑盒產品(pin)實(shi)驗(yan)的反(fan)應(ying)五(wu)要(yao)素(su)：

參(can)加(jia)PCR反(fan)應(ying)的物(wu)質(zhi)主要(yao)有五(wu)種(zhong)即(ji)引物(wu)、酶(mei)、dNTP、模板和Mg2+
引物(wu)：引物(wu)是PCR特異(yi)性反(fan)應(ying)的關鍵(jian)，PCR 產(chan)物(wu)的特異(yi)性取決(jue)於(yu)引(yin)物(wu)與模板DNA互(hu)補的程(cheng)度。理(li)論(lun)上，只要(yao)知道任(ren)何(he)壹段模板DNA序列， 就(jiu)能按其設(she)計(ji)互(hu)補的寡核(he)苷(gan)酸鏈(lian)做(zuo)引(yin)物(wu)，利用(yong)PCR就(jiu)可將模板DNA在體(ti)外大量擴(kuo)增。設(she)計(ji)引物(wu)應(ying)遵循(xun)以(yi)下原則(ze)：
①引(yin)物(wu)長度： 5-30bp，常用(yong)為20bp左右(you)。
②引物(wu)擴(kuo)增跨(kua)度： 以(yi)200-500bp為宜(yi)，特定(ding)條件下可擴(kuo)增長至(zhi)0kb的片段。
③引(yin)物(wu)堿基：G+C含(han)量以40-60%為宜(yi)，G+C太少擴(kuo)增效果(guo)不(bu)佳(jia)，G+C過(guo)多(duo)易出(chu)現(xian)非特異(yi)條帶。ATGC*隨(sui)機(ji)分(fen)布，避(bi)免(mian)5個(ge)以上的嘌呤(ling)或(huo)嘧啶核苷(gan)酸的成(cheng)串(chuan)排(pai)列。
④避(bi)免(mian)引(yin)物(wu)內(nei)部出現二級(ji)結(jie)構，避(bi)免(mian)兩條引(yin)物(wu)間(jian)互(hu)補，特別(bie)是3'端(duan)的互(hu)補，否則(ze)會形成(cheng)引(yin)物(wu)二聚(ju)體(ti)，產生非特異(yi)的擴(kuo)增條帶。
⑤引物(wu)3'端(duan)的堿基，特別(bie)是zui末(mo)及倒數(shu)第(di)二個堿(jian)基，應(ying)嚴格(ge)要(yao)求配(pei)對(dui)，以避(bi)免(mian)因(yin)末(mo)端(duan)堿基不(bu)配(pei)對(dui)而導(dao)致(zhi)PCR失(shi)敗(bai)。
⑥引物(wu)中有或(huo)能加(jia)上(shang)合適(shi)的酶(mei)切位點(dian)， 被(bei)擴(kuo)增的靶序(xu)列*有適(shi)宜(yi)的酶(mei)切位點(dian)， 這(zhe)對(dui)酶(mei)切分析(xi)或分子克(ke)隆很有好處。
⑦引物(wu)的特異(yi)性：引物(wu)應(ying)與核(he)酸序(xu)列數(shu)據(ju)庫的其它(ta)序(xu)列無明(ming)顯同源性(xing)。
引(yin)物(wu)量：每條引(yin)物(wu)的濃度0.～umol或(huo)0～00pmol，以(yi)*引物(wu)量產生所(suo)需要(yao)的結(jie)果(guo)為好，引物(wu)濃度偏(pian)高會引起錯(cuo)配(pei)和非特異(yi)性擴(kuo)增，且可增加(jia)引(yin)物(wu)之間(jian)形成(cheng)二聚(ju)體(ti)的機(ji)會。