【概要描(miao)述(shu)】Myc融和(he)蛋(dan)白(bai)純化試(shi)劑(ji)盒 Western免疫印(yin)跡(ji)(Western Blot)是(shi)將蛋(dan)白(bai)質(zhi)轉移(yi)到(dao)膜上(shang)，然後(hou)利用(yong)抗(kang)體進行(xing)檢測(ce)。

Myc融和(he)蛋(dan)白(bai)純化試(shi)劑(ji)盒  Western Blot技術: 做(zuo)線(xian)粒體膜UCP2蛋(dan)白(bai)的Western Blot （以(yi)下(xia)簡寫(xie)成Western Blot），提取(qu)線(xian)粒(li)體後(hou)凍存(cun)（未加蛋(dan)白(bai)酶抑(yi)制劑(ji)），樣(yang)品(pin)不能(neng)反復(fu)凍(dong)融;，加蛋(dan)白(bai)酶抑(yi)制劑(ji)。同時，建議(yi)檢查(zha)Western Blot過(guo)程， 提高(gao)壹(yi)抗(kang)濃(nong)度(du)。對(dui)於(yu)加蛋(dan)白(bai)酶抑(yi)制劑(ji)來(lai)說，壹(yi)般(ban)加PMSF就可(ke)以(yi)了(le)，能多加幾中(zhong)種(zhong)蛋(dan)白(bai)酶抑(yi)制劑(ji)。
同壹蛋(dan)白(bai)樣(yang)品(pin)能同時進行(xing)兩(liang)種因(yin)子的Western Blot檢測(ce)，有的甚(shen)至(zhi)可以(yi)同時測(ce)幾十種(zhong)樣(yang)Myc融和(he)蛋(dan)白(bai)純化試(shi)劑(ji)盒  如(ru)果是(shi)膜蛋(dan)白(bai)和胞(bao)漿(jiang)蛋(dan)白(bai)，所用(yong)的(de)去(qu)垢(gou)劑就(jiu)要溫(wen)和得(de)多，這時加上NaF去(qu)抑制磷#化酶的(de)活(huo)性(xing)。
樣(yang)品(pin)的蛋(dan)白(bai)含(han)量(liang)很(hen)低(di)，每(mei)微(wei)升(sheng)不到(dao)微克(ke)，但是(shi)在轉膜時經常會(hui)發現只(zhi)有壹部分(fen)蛋(dan)白(bai)轉到了(le)膜上(shang)，就是(shi)在轉膜後(hou)染(ran)膠(jiao)發現有的孔所有的蛋(dan)白(bai)條帶都(dou)在，只(zhi)是(shi)顏(yan)色(se)變淡了(le)，可以加大上(shang)樣(yang)量(liang)，轉移(yi)時可以用(yong)減(jian)少(shao)電流(liu)延長(chang)時間，多加5-0%甲醇。
想(xiang)分(fen)離(li)的(de)蛋(dan)白(bai)是(shi)分(fen)子量260kd的(de)，SDS-PAGE電泳(yong)的分(fen)離(li)膠(jiao)濃(nong)度(du)用6%，Stacking Gel 3.5%，但260kd的蛋(dan)白(bai)不好(hao)做(zuo)
如(ru)果上(shang)樣(yang)量(liang)超載(zai)，可(ke)以(yi)濃(nong)縮樣(yang)品(pin)，也(ye)可以根(gen)據妳的(de)目(mu)標分(fen)子量透(tou)析(xi)掉(diao)壹部分(fen)小分(fen)子蛋(dan)白(bai)。壹般(ban)地(di)，超(chao)載(zai)30%是(shi)不會(hui)有問題(ti)的(de)。如(ru)果已(yi)經(jing)超了(le)不少(shao)了(le)，而(er)且小分(fen)子量的(de)也(ye)要，可(ke)以考(kao)慮加大膠(jiao)的厚度(du)，可以(yi)試(shi)試(shi).5mm的(de) comb。
蛋(dan)白(bai)變性(xing)後(hou)存(cun)放-80℃，壹(yi)兩年沒(mei)有問題(ti)，zui關鍵(jian)兩條：不要被(bei)蛋(dan)白(bai)酶水解掉;不要被(bei)細菌消化掉（也(ye)是(shi)被(bei)酶(mei)水解了(le)）。
采(cai)用DAB顯(xian)色(se)技術，二(er)抗(kang)是(shi)化的多(duo)克(ke)隆抗(kang)體，三(san)抗(kang)是(shi)親(qin)和素(su)體系(xi)，不能(neng)使用(yong)脫脂奶(nai)粉(fen)，脫脂奶(nai)粉(fen)會影響親(qin)和素(su)的生(sheng)成，因(yin)為脫脂奶(nai)粉(fen)中含(han)，用(yong)BSA代(dai)替應該好(hao)壹(yi)點(dian) Western Blot壹般上樣(yang)30-00微(wei)克(ke)不等(deng)，結果跟(gen)目(mu)的蛋(dan)白(bai)的豐度、上(shang)樣(yang)量(liang)、壹二(er)抗(kang)的量和(he)撫(fu)育時間都(dou)有關系(xi)，也(ye)與顯(xian)色(se)時間長(chang)短(duan)有關。開(kai)始摸(mo)條件(jian)時，為了(le)拿到陽(yang)性(xing)結果，各(ge)個步(bu)驟都(dou)可以(yi)量多(duo)壹點時間長(chang)壹(yi)點(dian)，當(dang)然(ran)背(bei)景(jing)也(ye)就出來了(le)。要拿(na)到好(hao)的(de)結(jie)果，如(ru)果抗(kang)體好(hao)的(de)話比(bi)較(jiao)容易(yi)，抗(kang)體不好(hao)的(de)話就(jiu)需(xu)要反復(fu)地(di)試(shi)了(le)，當(dang)然(ran)有的不適(shi)合Western Blot的怎(zen)樣(yang)做(zuo)也(ye)不行(xing)。所(suo)以拿到好(hao)的(de)結(jie)果不容易(yi)。

  壹、 原理

與Southern或Northern雜(za)交方(fang)法類似，但Western Blot采(cai)用的(de)是(shi)聚(ju)丙(bing)烯(xi)酰(xian)胺凝(ning)膠(jiao)電泳(yong)，被(bei)檢測(ce)物是(shi)蛋(dan)白(bai)質(zhi)，“探(tan)針”是(shi)抗(kang)體，“顯(xian)色(se)”用(yong)標記的(de)二抗(kang)。經過(guo)PAGE分(fen)離(li)的(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)樣(yang)品(pin)，轉移(yi)到(dao)固相載(zai)體(ti)（例(li)如(ru)硝#纖維(wei)素(su)薄(bo)膜）上(shang)，固相(xiang)載(zai)體(ti)以(yi)非共價(jia)鍵(jian)形式(shi)吸(xi)附(fu)蛋(dan)白(bai)質(zhi)，且(qie)能(neng)保(bao)持電泳(yong)分(fen)離(li)的(de)多(duo)肽(tai)類型及其生(sheng)物學活(huo)性(xing)不變。以固(gu)相(xiang)載(zai)體(ti)上(shang)的(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)或多肽(tai)作(zuo)為抗(kang)原，與對(dui)應(ying)的(de)抗(kang)體起免疫反應(ying)，再(zai)與酶(mei)或同位(wei)素(su)標記的(de)第二抗(kang)體起反應(ying)，經(jing)過(guo)底物(wu)顯(xian)色(se)或放射(she)自(zi)顯(xian)影以檢測(ce)電泳(yong)分(fen)離(li)的(de)特(te)異(yi)性(xing)目(mu)的基(ji)因(yin)表達的蛋(dan)白(bai)成分(fen)。該技術也(ye)廣泛應用於(yu)檢測(ce)蛋(dan)白(bai)水平的表(biao)達。

二、分(fen)類(lei)  現常用(yong)的(de)有底物(wu)化學發光ECL和(he)底物(wu)DAB呈(cheng)色(se)，體同水平和實(shi)驗(yan)條件(jian)的(de)是(shi)用*種(zhong)方法(fa)，目(mu)前發表文(wen)章通(tong)常是(shi)用底物(wu)化學發光ECL。只(zhi)要買(mai)現成的試(shi)劑(ji)盒就行(xing)，操作(zuo)也(ye)比較(jiao)簡單(dan)，原理如(ru)下(xia)（二抗(kang)用HRP標記）：反應(ying)底物(wu)為過(guo)氧(yang)化物+魯(lu)米(mi)諾，如(ru)遇到(dao)HRP，即(ji)發光，可(ke)使膠(jiao)片(pian)曝(pu)光，就(jiu)可洗(xi)出條帶。

三(san)、 主(zhu)要試(shi)劑(ji)

、 丙(bing)烯(xi)酰(xian)胺和N，N’-亞(ya)甲雙(shuang)丙(bing)烯(xi)酰(xian)胺，應以溫(wen)熱(re)（以(yi)利於(yu)溶解雙(shuang)丙(bing)稀酰(xian)胺(an)）的(de)去(qu)離(li)子水配制含(han)有29%（w/v）丙(bing)稀酰(xian)胺(an)和(he)%（w/v）N，N’-亞(ya)甲雙(shuang)丙(bing)烯(xi)酰(xian)胺儲存(cun)液丙(bing)稀酰(xian)胺(an)29g，N，N-亞(ya)甲叉(cha)雙(shuang)丙(bing)稀酰(xian)胺(an)g，加H2O至(zhi) 00ml。）儲於棕(zong)色(se)瓶，4℃避光保(bao)存(cun)。嚴(yan)格核實(shi)PH不得(de)超過(guo)7.0，因(yin)可以(yi)發生(sheng)脫氨基(ji)反應(ying)是(shi)光催化或堿(jian)催化的。使(shi)用期(qi)不得(de)超過(guo)兩(liang)個月(yue)，隔(ge)幾個月(yue)須(xu)重新配制。如(ru)有沈澱(dian)，可以(yi)過(guo)濾。  2、 十二(er)烷基(ji)硫(liu)#鈉SDS溶液:0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去(qu)離(li)子水配制，室(shi)溫(wen)保存(cun)。

3、 分(fen)離(li)膠(jiao)緩沖(chong)液(ye):.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和(he)48mlmol/L HCl 混合，加水稀釋到(dao)00ml終體積。過(guo)濾後(hou)40℃保存(cun)。

4、 濃(nong)縮膠(jiao)緩沖(chong)液(ye):0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶於40mlH2O中(zhong)，用(yong)約(yue)48ml mol/L HCl調至(zhi)pH6.8加水稀釋到(dao)00ml終體積。過(guo)濾後(hou)40C保存(cun)。這兩種(zhong)緩(huan)沖(chong)液(ye)必(bi)須使用Tris堿(jian)制備，再(zai)用HCL調節(jie)PH值(zhi)，而(er)不用(yong) Tris.CL。

5、 TEMED原溶液N，N，N’N’四(si)甲基(ji)乙二胺催化過(guo)硫(liu)#銨形成自(zi)由基(ji)而(er)加速兩種(zhong)丙(bing)稀酰(xian)胺(an)的(de)聚(ju)合。PH太(tai)低(di)時，聚(ju)合反應(ying)受到(dao)抑(yi)制。0%（w/v）過(guo)硫(liu)#胺溶液。提供(gong)兩(liang)種(zhong)丙(bing)稀酰(xian)胺(an)聚(ju)合所必(bi)須的自(zi)由基(ji)。去(qu)離(li)子水配制數(shu)ml，臨(lin)用(yong)前配制.

6、 SDS- PAGE加樣(yang)緩(huan)沖(chong)液(ye):pH6.8 0.5mol/L Tris緩(huan)沖(chong)液(ye)8ml，甘油6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰基(ji)乙醇3.2ml，0.05%溴酚(fen)藍(lan).6ml，H2O 32ml混勻(yun)備用。按(an):或:2比(bi)例(li)與(yu)蛋(dan)白(bai)質(zhi)樣(yang)品(pin)混合，在沸(fei)水終煮(zhu)3min混勻(yun)後(hou)再(zai)上樣(yang)，壹(yi)般為20-25ul，總(zong)蛋(dan)白(bai)量00μg。

7、 Tris-甘氨#電泳(yong)緩沖(chong)液(ye):30.3gTris，88g甘氨#，0gSDS，用(yong)蒸(zheng)餾(liu)水溶解至(zhi)000ml，得(de)0.25mol/L Tris-.92mol/L甘氨#電極(ji)緩(huan)沖(chong)液(ye)。臨用(yong)前(qian)稀釋0倍(bei)。

8、 轉移(yi)緩(huan)沖(chong)液(ye)：配制L轉移(yi)緩(huan)沖(chong)液(ye)，需稱(cheng)取(qu)2.9g甘氨#、5.8gTris堿(jian)、0.37g SDS，並(bing)加入200ml甲醇，加水至(zhi)總量(liang)L。

9、 麗春(chun)紅染(ran)液儲(chu)存(cun)液：麗春(chun)紅S 2g 三(san)#乙#30g 磺(huang)基(ji)水楊# 30g 加水至(zhi)00ml 用時上述(shu)儲存(cun)液稀釋0倍(bei)即(ji)成麗春(chun)紅S使(shi)用液(ye)。使(shi)用後(hou)應予(yu)以廢棄。

0、 脫脂奶(nai)粉(fen)5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊(die)氮(dan)鈉（有毒(du)，戴(dai)手(shou)套操作(zuo)），溶於磷#緩沖(chong)鹽(yan)溶液（PBS）。

2、 Tris緩沖(chong)鹽(yan)溶液（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠(shu)抗(kang)人-MMP-9（6）鼠(shu)抗(kang)人-TIMP-。

4、 過(guo)氧(yang)化物酶(mei)標記的(de)第二抗(kang)體。

5、 NBT（溶於70%二(er)甲基(ji)甲酰胺，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶於00%二(er)甲基(ji)甲酰胺，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。