【概(gai)要(yao)描(miao)述(shu)】兔(tu)羊(yang)膜間(jian)質(zhi)細胞(bao)的相(xiang)關產品：SSP-25人(ren)肝膽(dan)管癌(ai)細胞(bao)人(ren)原代(dai)瘢痕疙(ge)瘩(da)成(cheng)纖維細胞(bao)人(ren)原代(dai)皮脂腺(xian)細(xi)胞(bao)人(ren)原代(dai)黑色細(xi)胞(bao)人(ren)原代(dai)子宮內(nei)膜間(jian)充質(zhi)幹細胞(bao)人(ren)原代(dai)結腸間質(zhi)細胞(bao)羊(yang)原代(dai)腎微(wei)血(xue)管內(nei)皮細胞(bao)小鼠(shu)原代(dai)腎周細胞(bao)大(da)鼠(shu)原代(dai)肺大(da)動脈(mai)外膜成(cheng)纖維細胞(bao)雞(ji)支(zhi)氣(qi)管(guan)上皮細胞(bao)

兔(tu)羊(yang)膜間(jian)質(zhi)細胞(bao)

培(pei)養(yang)基 含FBS、生(sheng)長(chang)添(tian)加(jia)劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率(lv) 每(mei)2-3天換液壹(yi)次

生(sheng)長(chang)特(te)性(xing) 貼(tie)壁(bi)

細(xi)胞(bao)形(xing)態 成(cheng)纖維細胞(bao)樣

傳(chuan)代(dai)特(te)性(xing) 可(ke)傳(chuan)3代(dai)左右

消(xiao)化液 0.25%yi蛋(dan)白(bai)酶

培(pei)養(yang)條件(jian) 氣(qi)相(xiang)：空(kong)氣，95%；CO2，5%

兔(tu)羊(yang)膜間(jian)質(zhi)分離自(zi)胎(tai)盤(pan)組(zu)織；胎(tai)盤（placenta）是(shi)哺(bu)乳(ru)動(dong)物妊(ren)娠期間由胚(pei)胎(tai)的胚(pei)膜和(he)母體子宮內(nei)膜聯合(he)長(chang)成(cheng)的母(mu)子間交(jiao)換物(wu)質(zhi)的過(guo)渡(du)性(xing)器(qi)官(guan)，由羊(yang)膜、葉狀絨(rong)毛膜和(he)底(di)蛻膜構成(cheng)。胎兒在(zai)子宮中(zhong)發育(yu)，依(yi)靠(kao)胎(tai)盤從母體取(qu)得(de)營養，而(er)雙(shuang)方(fang)保持(chi)相(xiang)當的獨立性(xing)。胎(tai)盤(pan)還產生多種維持(chi)妊(ren)娠的激(ji)素，是(shi)壹(yi)個重(zhong)要的內(nei)分泌(mi)器(qi)官(guan)。有些爬行(xing)類(lei)和魚(yu)類(lei)也以胎生方(fang)式(shi)繁(fan)殖(zhi)後(hou)代(dai)，胚胎生長出壹(yi)些輔助(zhu)結(jie)構如卵黃(huang)囊(nang)、鰓(sai)絲(si)等與(yu)母體組(zu)織緊(jin)密(mi)結(jie)合(he)，以(yi)達(da)到(dao)母子間物(wu)質(zhi)的交(jiao)換，這(zhe)樣的結(jie)構稱(cheng)假(jia)胎盤。羊(yang)膜是(shi)胎盤(pan)的最內(nei)層，與(yu)眼(yan)結膜組(zu)織結(jie)構相(xiang)似(si)，含有(you)眼(yan)表上皮細胞(bao)，包(bao)括(kuo)結(jie)膜細(xi)胞(bao)和(he)角膜上皮細胞(bao)生(sheng)長所需要(yao)的物(wu)質(zhi)，其光(guang)滑(hua)，無(wu)血(xue)管(guan)、神(shen)經及淋(lin)巴(ba)，具(ju)有(you)壹(yi)定的彈(dan)性(xing)；在(zai)電(dian)鏡(jing)下(xia)，其分(fen)為(wei)五層：上皮層、基底(di)膜、致(zhi)密(mi)層、纖維母細(xi)胞(bao)層和(he)海(hai)綿(mian)層，羊(yang)膜基底(di)膜和(he)羊(yang)膜羊(yang)膜基質(zhi)層含有(you)大(da)量不(bu)同(tong)的膠元(yuan)，主要為(wei)Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型(xing)膠原和(he)纖維粘連(lian)蛋(dan)白、層粘(zhan)連(lian)蛋(dan)白(bai)等成(cheng)份(fen)。羊(yang)膜細(xi)胞(bao)主要由(you)羊(yang)膜上皮細胞(bao)和(he)羊(yang)膜間(jian)充質(zhi)細胞(bao)組(zu)成(cheng)，均(jun)具有(you)多分化潛能，可(ke)轉(zhuan)化為神(shen)經元(yuan)，且還有(you)合(he)成(cheng)、釋(shi)放生物(wu)活(huo)性(xing)物(wu)質(zhi)和神(shen)經營養(yang)因子的功(gong)能。
方(fang)法(fa)簡(jian)介(jie)：

公(gong)司實(shi)驗室分(fen)離(li)的兔(tu)羊(yang)膜間(jian)質(zhi)采用yi蛋(dan)白(bai)酶-膠原酶(mei)混(hun)合(he)消(xiao)化法結(jie)合(he)差(cha)速(su)貼(tie)壁(bi)法，並通(tong)過上皮細胞(bao)專(zhuan)用培養基培(pei)養(yang)篩(shai)選(xuan)制(zhi)備而(er)來，細(xi)胞(bao)總(zong)量約為5×10?cells/瓶。
質(zhi)量檢測：

公(gong)司實(shi)驗室分(fen)離(li)的兔(tu)羊(yang)膜間(jian)質(zhi)經Vimentin免(mian)疫熒光(guang)鑒(jian)定(ding)，純(chun)度(du)可(ke)達(da)90%以上，且不(bu)含有(you)HIV-1、HBV、HCV、支(zhi)原(yuan)體、細(xi)菌(jun)、酵母(mu)和真菌等。

壹(yi)、細胞(bao)培(pei)養

1取(qu)材 在無(wu)菌(jun)環境(jing)下(xia)從機(ji)體取(qu)出某(mou)種組(zu)織細(xi)胞(bao)（視實(shi)驗目的而(er)定），經過壹(yi)定的處(chu)理（如消(xiao)化分散(san)細(xi)胞(bao)、分(fen)離等）後(hou)接(jie)入培(pei)養器(qi)血(xue)中(zhong)，這(zhe)壹(yi)過程(cheng)稱(cheng)為(wei)取材。如是(shi)細胞(bao)株的擴大(da)培養(yang)則無(wu)取材這壹(yi)過程(cheng)。機(ji)體取(qu)出的組(zu)織細(xi)胞(bao)的培(pei)養稱(cheng)為(wei)原代(dai)培養。2培養 將(jiang)取得(de)的組(zu)織細(xi)胞(bao)接(jie)入培(pei)養瓶(ping)或培養(yang)板中(zhong)的過(guo)程(cheng)稱(cheng)為(wei)培養。3凍存及復(fu)蘇(su)（可(ke)參(can)閱後(hou)面有(you)關(guan)章節）為了保存細(xi)胞(bao)，特(te)別是(shi)不(bu)易(yi)獲(huo)得(de)的突(tu)變(bian)型細胞(bao)或細胞(bao)株，要將(jiang)細胞(bao)凍(dong)存。凍(dong)存的溫(wen)度(du)壹(yi)般(ban)用液氮(dan)的溫(wen)度(du)－196℃，將(jiang)細胞(bao)收(shou)集至凍存管(guan)中加(jia)入(ru)含保護(hu)劑(ji)（壹(yi)般(ban)為二甲(jia)亞(ya)碸(feng)或甘(gan)油(you)）的培(pei)養基，以(yi)壹(yi)定的冷(leng)卻速(su)度(du)凍存，最終保存於液氮(dan)中。在(zai)極低的溫(wen)度(du)下(xia)，細(xi)胞(bao)保存的時間(jian)幾乎是無(wu)限(xian)的。復(fu)蘇(su)壹(yi)般(ban)采用快(kuai)融(rong)方(fang)法(fa)，即從液氮(dan)中取(qu)出凍存管(guan)後(hou)，立即放入37℃水中(zhong)，使(shi)之在壹(yi)分鐘(zhong)內迅速(su)融(rong)解。然後(hou)將(jiang)細胞(bao)轉(zhuan)入培養器(qi)皿(min)中(zhong)進(jin)行(xing)培(pei)養(yang)。

二、原(yuan)代(dai)細胞(bao)分(fen)離

凡(fan)是來源於胚胎(tai)、組(zu)織器(qi)官(guan)及外周血，經特(te)殊分離方(fang)法(fa)制(zhi)備而(er)來的原(yuan)初(chu)培(pei)養的細(xi)胞(bao)稱(cheng)之為原代(dai)細胞(bao)。1懸(xuan)浮細胞(bao)的分(fen)離方(fang)法(fa)組(zu)織材料若來自(zi)血(xue)液、羊(yang)水、胸水或腹(fu)水的懸(xuan)液材料，的方(fang)法(fa)是(shi)采用1000r/min的低速(su)離(li)心(xin)10分鐘。經離心(xin)後(hou)由於各(ge)種細(xi)胞(bao)的比(bi)重(zhong)不(bu)同(tong)可(ke)在(zai)分層液中形(xing)成(cheng)不(bu)同(tong)層，這(zhe)樣可(ke)根(gen)據需要收(shou)獲(huo)目的細(xi)胞(bao)。2實(shi)體組(zu)織材料的分(fen)離方(fang)法(fa)對(dui)於實(shi)體組(zu)織材料，由(you)於細胞(bao)間(jian)結合(he)緊(jin)密(mi)，為(wei)了使(shi)組(zu)織中(zhong)的細(xi)胞(bao)充(chong)分分散，形(xing)成(cheng)細胞(bao)懸(xuan)液，可(ke)采用機(ji)械(xie)分(fen)散(san)法(fa)（物(wu)理裂解）和消(xiao)化分離(li)法(fa)。

三(san)、細(xi)胞(bao)增(zeng)殖(zhi)檢測技(ji)術

目前(qian)主要有(you)兩(liang)種用(yong)於檢測細胞(bao)增(zeng)殖(zhi)能力(li)的方(fang)法(fa)。壹(yi)種是(shi)直接(jie)的方(fang)法(fa)，通(tong)過直接(jie)測定進(jin)行(xing)分(fen)裂

的細(xi)胞(bao)數(shu)來評(ping)價(jia)細胞(bao)的增(zeng)殖(zhi)能力(li)。另壹(yi)種是(shi)間接(jie)的方(fang)法(fa)，即細(xi)胞(bao)活(huo)力（cell viability）檢(jian)測方(fang)法(fa)，通(tong)過檢測樣品中(zhong)健(jian)康細胞(bao)的數(shu)目來評(ping)價(jia)細胞(bao)的增(zeng)殖(zhi)能力(li)。顯然(ran)，細(xi)胞(bao)活(huo)力檢(jian)測法並(bing)不(bu)能最終證(zheng)明檢(jian)測樣品中(zhong)的細(xi)胞(bao)是(shi)否(fou)在(zai)增(zeng)殖(zhi)。如細(xi)胞(bao)在(zai)某(mou)壹(yi)培養(yang)條件(jian)下(xia)會(hui)自發(fa)啟動雕(diao)亡程(cheng)序，但(dan)藥(yao)物的幹(gan)擾可(ke)抑制雕(diao)亡的發(fa)生；這時若采用細胞(bao)活(huo)力檢(jian)測法，顯然(ran)可(ke)以(yi)區分兩種條(tiao)件(jian)下(xia)的細(xi)胞(bao)數(shu)量，但我(wo)們(men)並(bing)不(bu)能從藥(yao)物幹(gan)擾組(zu)細胞(bao)數(shu)大(da)於對照組(zu)的事(shi)實(shi)說明藥(yao)物可(ke)促(cu)進(jin)細(xi)胞(bao)增(zeng)殖(zhi)的結(jie)論(lun)。所(suo)以(yi)最直(zhi)接(jie)的證(zheng)據應該采用方(fang)法(fa)壹(yi)。

取(qu)材：首(shou)先，用培(pei)養液濕潤(run)所取(qu)的組(zu)織材料，並(bing)用(yong)鋒利的眼(yan)科剪(jian)去(qu)除(chu)附在(zai)其上的脂肪和(he)結(jie)締組(zu)織。接(jie)著用平(ping)衡液（如PBS或Hanks液）漂(piao)洗(xi)，再(zai)用(yong)眼(yan)科彎(wan)剪(jian)將(jiang)組(zu)織塊(kuai)剪(jian)成(cheng)小塊(kuai)。多次用PBS或Hanks液漂(piao)洗(xi)，直(zhi)到液體清(qing)亮(liang)、無油滴為止(zhi)。

接(jie)種：用(yong)濕潤的吸(xi)管(guan)吸(xi)取(qu)切(qie)碎的組(zu)織塊(kuai)，輕輕(qing)吹到培(pei)養瓶皿(min)中(zhong)，並(bing)按(an)壹(yi)定間(jian)距均(jun)勻(yun)放在培(pei)養(yang)瓶底(di)壁(bi)上。註意(yi)不(bu)要(yao)過(guo)多，確(que)保組(zu)織塊(kuai)切(qie)面貼(tie)在培養瓶底(di)壁(bi)上。

培(pei)養(yang)：將(jiang)培養(yang)瓶翻(fan)轉，使(shi)瓶(ping)底(di)朝(chao)上，在種植(zhi)了組(zu)織塊(kuai)壹(yi)側的對(dui)側面加足(zu)培(pei)養液，避(bi)免(mian)組(zu)織塊(kuai)與培(pei)養(yang)液接(jie)觸，然(ran)後(hou)塞緊(jin)瓶(ping)塞。將(jiang)種植(zhi)了組(zu)織塊(kuai)的壹(yi)側朝(chao)上，靜置(zhi)於37℃培養(yang)箱中。待組(zu)織塊(kuai)貼壁(bi)1到3小時後(hou)翻瓶(ping)，使(shi)貼(tie)壁(bi)的組(zu)織塊(kuai)浸沒在培(pei)養(yang)液中，繼續靜置(zhi)。換液：每隔2到3天更(geng)換壹(yi)次培(pei)養液，或者根(gen)據培(pei)養(yang)瓶(ping)種顏色的變(bian)化確(que)定換液時間(jian)。

壹(yi)、原代(dai)細胞(bao)計數(shu)

將(jiang)血球計數(shu)板(ban)及蓋片(pian)用(yong)擦試(shi)幹(gan)凈，並將(jiang)蓋片(pian)蓋(gai)在(zai)計數(shu)板(ban)上。

將(jiang)細胞(bao)懸(xuan)液吸(xi)出少許(xu)，滴加(jia)在蓋片(pian)邊(bian)緣(yuan)，使(shi)懸(xuan)液充滿(man)蓋(gai)片(pian)和(he)計數(shu)板(ban)之間。

靜置(zhi)3分鐘(zhong)。

鏡(jing)下(xia)觀(guan)察(cha)，計算計數(shu)板(ban)四(si)大(da)格細(xi)胞(bao)總(zong)數(shu)，壓(ya)線(xian)細(xi)胞(bao)只(zhi)計左側和上方(fang)的。然(ran)後(hou)按(an)下(xia)式(shi)計算：

細(xi)胞(bao)數(shu)/ml＝4大(da)格細(xi)胞(bao)總(zong)數(shu)/ 4×10000

註意(yi)：鏡下(xia)偶(ou)見由兩(liang)個以(yi)上細胞(bao)組(zu)成(cheng)的細(xi)胞(bao)團(tuan)，應按(an)單個(ge)細胞(bao)計算，若細胞(bao)團(tuan)占10%以(yi)上，說明分(fen)散不(bu)好(hao)，需(xu)重(zhong)新(xin)制(zhi)備細胞(bao)懸(xuan)液。

二、原(yuan)代(dai)細胞(bao)活(huo)力

將(jiang)細胞(bao)懸(xuan)液以0.5ml加(jia)入試(shi)管(guan)中。

加(jia)入(ru)0.5ml 0.4%臺盼蘭染(ran)液，染(ran)色2壹(yi)3分鐘(zhong)。

吸(xi)取(qu)少(shao)許(xu)懸液塗於載玻(bo)片(pian)上，加上蓋片(pian)。

鏡(jing)下(xia)取(qu)幾個任(ren)意(yi)視野分(fen)別計死細(xi)胞(bao)和(he)活(huo)細胞(bao)數(shu)，計細胞(bao)活(huo)力。

死細(xi)胞(bao)能被(bei)臺盼蘭染(ran)上色，鏡(jing)下(xia)可(ke)見深蘭色的細(xi)胞(bao)，活(huo)細胞(bao)不(bu)被(bei)染(ran)色，鏡(jing)下(xia)呈無(wu)色透(tou)明狀。

活(huo)力測定可(ke)以(yi)和細胞(bao)計數(shu)合(he)起(qi)來進(jin)行(xing)，但(dan)要(yao)考慮到染(ran)液對原(yuan)細胞(bao)懸(xuan)液的加(jia)倍稀(xi)釋(shi)作(zuo)用(yong)。