【概(gai)要(yao)描(miao)述(shu)】兔(tu)角(jiao)膜(mo)上皮細(xi)胞(bao)的(de)相關產品：HIBEpiC人肝(gan)內膽(dan)管上皮細(xi)胞(bao)人原(yuan)代(dai)腦(nao)動脈(mai)平滑(hua)肌(ji)細(xi)胞(bao)人原(yuan)代(dai)頸動脈(mai)平滑(hua)肌(ji)細(xi)胞(bao)人原(yuan)代(dai)卵(luan)巢微(wei)血管內皮(pi)細(xi)胞(bao)人原(yuan)代(dai)韌(ren)帶成纖維(wei)細(xi)胞(bao)人原(yuan)代(dai)食(shi)道(dao)平滑肌(ji)細(xi)胞(bao)小(xiao)鼠原代(dai)角(jiao)膜(mo)上皮細(xi)胞(bao)小(xiao)鼠原代(dai)肝(gan)kupffer細(xi)胞(bao)牛原(yuan)代(dai)前(qian)脂肪細(xi)胞(bao)兔原(yuan)代(dai)小(xiao)腸隱窩(wo)上皮細(xi)胞(bao)

兔(tu)角膜(mo)上皮細(xi)胞(bao)

包(bao)被(bei)條件(jian) 鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培養基 含(han)FBS、生(sheng)長添(tian)加劑、Penicillin、Streptomycin等(deng)

換(huan)液(ye)頻(pin)率(lv) 每(mei)2-3天(tian)換液(ye)壹次

生(sheng)長特(te)性(xing) 貼壁

細(xi)胞(bao)形態 上皮細(xi)胞(bao)樣

傳代(dai)特(te)性 可(ke)傳1-3代(dai)

消(xiao)化液(ye) 0.25%yi蛋白酶(mei)

培養條件 氣(qi)相：空氣(qi)，95%；CO2，5%

兔(tu)角膜(mo)上皮分(fen)離自(zi)眼(yan)角(jiao)膜(mo)組(zu)織(zhi)；角(jiao)膜(mo)位(wei)於眼(yan)球前(qian)壁的(de)壹層(ceng)透明(ming)膜(mo)，約(yue)占纖(xian)維(wei)膜(mo)的(de)前(qian)1/6，從(cong)後面(mian)看角(jiao)膜(mo)呈(cheng)正圓形，從前(qian)面(mian)看為橫橢(tuo)圓(yuan)形。角膜(mo)厚(hou)度(du)各(ge)部分(fen)不(bu)盡(jin)相同，中央(yang)部最薄(bo)。角膜(mo)有十(shi)分(fen)敏感的(de)神經(jing)末(mo)梢，如有(you)外物接觸(chu)角膜(mo)，眼(yan)瞼(jian)便(bian)會(hui)不(bu)由(you)自(zi)主(zhu)地合(he)上以(yi)保護(hu)眼(yan)睛(jing)。為了(le)保持(chi)透明(ming)，角膜(mo)並沒(mei)有血管，透過(guo)外界空氣(qi)、淚(lei)液(ye)及(ji)房(fang)水(shui)獲取養份(fen)及(ji)氧氣(qi)。角膜(mo)分(fen)為五層(ceng)，由(you)前(qian)向後(hou)依次為：上皮細(xi)胞(bao)層(ceng)、前(qian)彈力(li)層(ceng)、基質(zhi)層(ceng)、後(hou)彈力層(ceng)、內皮(pi)細(xi)胞(bao)層(ceng)。其(qi)主(zhu)要(yao)功(gong)能如(ru)下：①角膜(mo)是的(de)無血管的(de)組(zu)織(zhi)，具(ju)有(you)透明(ming)的(de)特性(xing)和合(he)成許(xu)多(duo)蛋白的(de)功(gong)能，分(fen)三層(ceng)細(xi)胞(bao)層(ceng)，外(wai)層(ceng)即是上皮細(xi)胞(bao)；②角膜(mo)上皮細(xi)胞(bao)能參(can)與先天(tian)性免(mian)疫(yi)，能感應(ying)病(bing)原體(ti)存(cun)在並(bing)發(fa)出(chu)信(xin)號從(cong)而激活角膜(mo)防禦系(xi)統；③角膜(mo)上皮細(xi)胞(bao)能高(gao)效表(biao)達(da)醛(quan)脫(tuo)氫(qing)酶(mei)。角(jiao)膜(mo)上皮細(xi)胞(bao)的(de)體(ti)外(wai)培養對研究角膜(mo)的(de)生理學(xue)、病(bing)理學(xue)、免(mian)疫(yi)學(xue)以(yi)及(ji)分(fen)子生物(wu)學(xue)都是(shi)極為重(zhong)要(yao)的(de)手(shou)段，常用於研(yan)究細(xi)胞(bao)代(dai)謝產(chan)物(wu)、病(bing)毒感染(ran)、各(ge)種(zhong)生長因(yin)子和藥(yao)物對(dui)細(xi)胞(bao)生長(chang)的(de)影響(xiang)。
方(fang)法簡(jian)介(jie)：

公司(si)實(shi)驗(yan)室(shi)分(fen)離的(de)兔角(jiao)膜(mo)上皮采(cai)用混合(he)膠原酶(mei)消(xiao)化結(jie)合(he)上皮細(xi)胞(bao)專(zhuan)用培養基培養篩選(xuan)制(zhi)備(bei)而來(lai)，細(xi)胞(bao)總量約(yue)為5×10?cells/瓶。
質(zhi)量檢測：

公司(si)實(shi)驗(yan)室(shi)分(fen)離的(de)兔角(jiao)膜(mo)上皮經(jing)PCK免(mian)疫(yi)熒(ying)光(guang)鑒定(ding)，純(chun)度(du)可(ke)達(da)90%以(yi)上，且不(bu)含(han)有HIV-1、HBV、HCV、支原(yuan)體(ti)、細(xi)菌、酵(jiao)母(mu)和真菌等(deng)。

壹(yi)、細(xi)胞(bao)培養

1取材 在無(wu)菌環境(jing)下從(cong)機體(ti)取出(chu)某種組(zu)織(zhi)細(xi)胞(bao)（視實(shi)驗(yan)目(mu)的(de)而定(ding)），經(jing)過(guo)壹(yi)定(ding)的(de)處理（如消(xiao)化分(fen)散細(xi)胞(bao)、分(fen)離等(deng)）後(hou)接入(ru)培養器(qi)血中，這(zhe)壹(yi)過(guo)程(cheng)稱為取材。如(ru)是(shi)細(xi)胞(bao)株(zhu)的(de)擴大培養則(ze)無(wu)取材這(zhe)壹(yi)過程(cheng)。機體(ti)取出(chu)的(de)組(zu)織(zhi)細(xi)胞(bao)的(de)培養稱為原代(dai)培養。2培養 將(jiang)取得(de)的(de)組(zu)織(zhi)細(xi)胞(bao)接入(ru)培養瓶或(huo)培養板中的(de)過程(cheng)稱為培養。3凍存及(ji)復(fu)蘇(su)（可(ke)參(can)閱(yue)後面(mian)有關章節）為了(le)保存(cun)細(xi)胞(bao)，特別(bie)是不(bu)易獲得(de)的(de)突變型細(xi)胞(bao)或(huo)細(xi)胞(bao)株(zhu)，要(yao)將(jiang)細(xi)胞(bao)凍存(cun)。凍存(cun)的(de)溫(wen)度(du)壹(yi)般(ban)用液(ye)氮(dan)的(de)溫(wen)度(du)－196℃，將(jiang)細(xi)胞(bao)收集(ji)至凍(dong)存管(guan)中加入含(han)保護(hu)劑（壹(yi)般(ban)為二甲(jia)亞碸(feng)或(huo)甘油）的(de)培養基，以(yi)壹定(ding)的(de)冷(leng)卻速(su)度(du)凍(dong)存(cun)，最終(zhong)保存(cun)於液(ye)氮(dan)中。在極(ji)低的(de)溫(wen)度(du)下(xia)，細(xi)胞(bao)保存(cun)的(de)時間幾乎是無限(xian)的(de)。復蘇(su)壹般(ban)采(cai)用快融(rong)方(fang)法，即從液(ye)氮(dan)中取出(chu)凍存管(guan)後(hou)，立(li)即放入37℃水(shui)中，使(shi)之(zhi)在壹(yi)分(fen)鐘內迅速融(rong)解。然後(hou)將(jiang)細(xi)胞(bao)轉入培養器(qi)皿中進(jin)行(xing)培養。

二(er)、原代(dai)細(xi)胞(bao)分(fen)離

凡是來(lai)源(yuan)於胚(pei)胎(tai)、組(zu)織(zhi)器(qi)官(guan)及(ji)外(wai)周(zhou)血，經(jing)特(te)殊分(fen)離方(fang)法制(zhi)備(bei)而來(lai)的(de)原初(chu)培養的(de)細(xi)胞(bao)稱之(zhi)為原代(dai)細(xi)胞(bao)。1懸浮(fu)細(xi)胞(bao)的(de)分(fen)離方(fang)法組(zu)織(zhi)材料若(ruo)來(lai)自血液(ye)、羊(yang)水(shui)、胸水(shui)或(huo)腹水(shui)的(de)懸液(ye)材料，的(de)方(fang)法是采(cai)用1000r/min的(de)低速離心(xin)10分(fen)鐘。經(jing)離(li)心(xin)後由(you)於各(ge)種(zhong)細(xi)胞(bao)的(de)比重(zhong)不(bu)同(tong)可(ke)在分(fen)層(ceng)液(ye)中形成不(bu)同(tong)層(ceng)，這(zhe)樣可根(gen)據(ju)需(xu)要(yao)收獲目(mu)的(de)細(xi)胞(bao)。2實(shi)體(ti)組(zu)織(zhi)材料的(de)分(fen)離方(fang)法對於實(shi)體(ti)組(zu)織(zhi)材料，由(you)於細(xi)胞(bao)間結合(he)緊(jin)密，為了(le)使(shi)組(zu)織(zhi)中的(de)細(xi)胞(bao)充分(fen)分(fen)散，形成細(xi)胞(bao)懸液(ye)，可采(cai)用機械(xie)分(fen)散法（物理裂(lie)解）和消(xiao)化分(fen)離法。

三(san)、細(xi)胞(bao)增(zeng)殖檢測(ce)技(ji)術(shu)

目(mu)前(qian)主(zhu)要(yao)有(you)兩種(zhong)用於檢(jian)測(ce)細(xi)胞(bao)增(zeng)殖能力(li)的(de)方(fang)法。壹種是直(zhi)接的(de)方(fang)法，通過直接測(ce)定(ding)進行(xing)分(fen)裂(lie)

的(de)細(xi)胞(bao)數(shu)來(lai)評價(jia)細(xi)胞(bao)的(de)增(zeng)殖能力(li)。另(ling)壹種(zhong)是間接的(de)方(fang)法，即細(xi)胞(bao)活力(li)（cell viability）檢測(ce)方(fang)法，通過檢測(ce)樣品中健(jian)康(kang)細(xi)胞(bao)的(de)數(shu)目(mu)來(lai)評價(jia)細(xi)胞(bao)的(de)增(zeng)殖能力(li)。顯然，細(xi)胞(bao)活力(li)檢測(ce)法並不(bu)能最終(zhong)證明(ming)檢測(ce)樣品中的(de)細(xi)胞(bao)是否(fou)在增(zeng)殖。如細(xi)胞(bao)在某壹培養條件下(xia)會(hui)自(zi)發(fa)啟(qi)動雕亡程(cheng)序(xu)，但(dan)藥(yao)物(wu)的(de)幹擾可抑制(zhi)雕亡的(de)發(fa)生(sheng)；這(zhe)時若(ruo)采(cai)用細(xi)胞(bao)活力(li)檢測(ce)法，顯然可以(yi)區分(fen)兩種(zhong)條(tiao)件下(xia)的(de)細(xi)胞(bao)數(shu)量，但(dan)我(wo)們(men)並(bing)不(bu)能從(cong)藥物幹擾組(zu)細(xi)胞(bao)數(shu)大於對(dui)照組(zu)的(de)事實(shi)說明(ming)藥(yao)物可(ke)促(cu)進細(xi)胞(bao)增(zeng)殖的(de)結論(lun)。所以(yi)最直(zhi)接的(de)證據(ju)應(ying)該(gai)采(cai)用方(fang)法壹。

取材：首(shou)先，用培養液(ye)濕潤所(suo)取的(de)組(zu)織(zhi)材料，並用鋒(feng)利的(de)眼(yan)科剪(jian)去除附在其(qi)上的(de)脂肪和結(jie)締組(zu)織(zhi)。接著(zhe)用平衡(heng)液(ye)（如PBS或(huo)Hanks液(ye)）漂洗，再用眼(yan)科彎(wan)剪將(jiang)組(zu)織(zhi)塊(kuai)剪成小(xiao)塊。多(duo)次(ci)用PBS或(huo)Hanks液(ye)漂洗，直到液(ye)體(ti)清(qing)亮、無(wu)油滴為止。

接種(zhong)：用濕潤的(de)吸(xi)管(guan)吸(xi)取切碎(sui)的(de)組(zu)織(zhi)塊(kuai)，輕(qing)輕(qing)吹(chui)到(dao)培養瓶皿中，並(bing)按壹(yi)定(ding)間距(ju)均勻放在培養瓶底壁上。註意(yi)不(bu)要(yao)過(guo)多(duo)，確(que)保組(zu)織(zhi)塊(kuai)切面(mian)貼在培養瓶底壁上。

培養：將(jiang)培養瓶翻轉，使(shi)瓶底朝(chao)上，在種(zhong)植(zhi)了(le)組(zu)織(zhi)塊(kuai)壹側的(de)對側面(mian)加足培養液(ye)，避免(mian)組(zu)織(zhi)塊(kuai)與培養液(ye)接觸(chu)，然後(hou)塞緊(jin)瓶塞。將(jiang)種植(zhi)了(le)組(zu)織(zhi)塊(kuai)的(de)壹側朝上，靜置(zhi)於37℃培養箱中。待(dai)組(zu)織(zhi)塊(kuai)貼壁1到3小(xiao)時後(hou)翻瓶，使(shi)貼壁的(de)組(zu)織(zhi)塊(kuai)浸沒在培養液(ye)中，繼續靜(jing)置(zhi)。換液(ye)：每隔2到3天(tian)更換壹次(ci)培養液(ye)，或(huo)者根(gen)據(ju)培養瓶種顏(yan)色(se)的(de)變化(hua)確(que)定(ding)換(huan)液(ye)時間。

壹(yi)、原代(dai)細(xi)胞(bao)計數(shu)

將(jiang)血球計數(shu)板及(ji)蓋(gai)片(pian)用擦試幹凈，並(bing)將(jiang)蓋片蓋在計數(shu)板上。

將(jiang)細(xi)胞(bao)懸液(ye)吸(xi)出(chu)少(shao)許(xu)，滴(di)加在蓋(gai)片(pian)邊緣(yuan)，使(shi)懸(xuan)液(ye)充滿蓋片和計數(shu)板之(zhi)間。

靜(jing)置(zhi)3分(fen)鐘。

鏡下(xia)觀(guan)察，計算(suan)計數(shu)板四(si)大格(ge)細(xi)胞(bao)總數(shu)，壓線細(xi)胞(bao)只計左(zuo)側和上方(fang)的(de)。然後(hou)按下(xia)式(shi)計算(suan)：

細(xi)胞(bao)數(shu)/ml＝4大格(ge)細(xi)胞(bao)總數(shu)/ 4×10000

註(zhu)意：鏡下(xia)偶見由(you)兩個以(yi)上細(xi)胞(bao)組(zu)成的(de)細(xi)胞(bao)團(tuan)，應(ying)按單(dan)個細(xi)胞(bao)計算(suan)，若(ruo)細(xi)胞(bao)團(tuan)占10%以(yi)上，說明(ming)分(fen)散不(bu)好(hao)，需(xu)重(zhong)新(xin)制(zhi)備(bei)細(xi)胞(bao)懸液(ye)。

二(er)、原代(dai)細(xi)胞(bao)活力(li)

將(jiang)細(xi)胞(bao)懸液(ye)以(yi)0.5ml加入試管中。

加入0.5ml 0.4%臺(tai)盼(pan)蘭(lan)染(ran)液(ye)，染(ran)色(se)2壹(yi)3分(fen)鐘。

吸(xi)取少(shao)許(xu)懸(xuan)液(ye)塗於載玻片(pian)上，加上蓋片(pian)。

鏡下(xia)取幾個任意視野(ye)分(fen)別計死細(xi)胞(bao)和活(huo)細(xi)胞(bao)數(shu)，計細(xi)胞(bao)活力(li)。

死細(xi)胞(bao)能被(bei)臺(tai)盼(pan)蘭(lan)染(ran)上色，鏡下(xia)可(ke)見深(shen)蘭(lan)色(se)的(de)細(xi)胞(bao)，活細(xi)胞(bao)不(bu)被(bei)染(ran)色(se)，鏡下(xia)呈(cheng)無色(se)透明(ming)狀(zhuang)。

活(huo)力測(ce)定(ding)可(ke)以(yi)和細(xi)胞(bao)計數(shu)合(he)起(qi)來(lai)進行(xing)，但(dan)要(yao)考(kao)慮(lv)到(dao)染(ran)液(ye)對原細(xi)胞(bao)懸液(ye)的(de)加倍稀(xi)釋作用。