【概要(yao)描述(shu)】兔骨髓(sui)間充質幹(gan)細(xi)胞(bao)的(de)相(xiang)關產品：CAL-12T人(ren)肺癌(ai)細胞(bao)小鼠(shu)原(yuan)代腦動(dong)脈血(xue)管內皮細(xi)胞(bao)HPASMC 人肺動(dong)脈平(ping)滑肌細胞兔原(yuan)代海綿(mian)體內(nei)皮(pi)細胞(bao)大(da)鼠(shu)原(yuan)代脊(ji)髓(sui)神經(jing)元細(xi)胞(bao)人(ren)原(yuan)代肝(gan)門靜(jing)脈成(cheng)纖維細胞(bao)人(ren)原(yuan)代外(wai)周血巨(ju)噬(shi)細(xi)胞(bao)兔原(yuan)代臍帶間(jian)充質幹(gan)細(xi)胞(bao)兔原(yuan)代脈絡(luo)膜(mo)微血(xue)管(guan)內皮(pi)細(xi)胞豬(zhu)原(yuan)代垂體細(xi)胞(bao)

兔骨髓(sui)間充質幹(gan)細(xi)胞(bao)

培(pei)養(yang)基(ji) 含(han)FBS、生(sheng)長(chang)添加(jia)劑(ji)、Penicillin、Streptomycin等(deng)

換液頻(pin)率(lv) 每(mei)2-3天(tian)換液壹(yi)次

生(sheng)長(chang)特性 貼(tie)壁(bi)

細(xi)胞(bao)形(xing)態 成(cheng)纖(xian)維細(xi)胞樣

傳(chuan)代特性 可(ke)傳(chuan)5代左右；3代以(yi)內(nei)狀(zhuang)態

消(xiao)化(hua)液 0.25%yi蛋(dan)白(bai)酶

培(pei)養(yang)條(tiao)件 氣(qi)相(xiang)：空氣(qi)，95%；CO2，5%

兔骨髓(sui)間充質（BMSC）分(fen)離(li)自(zi)骨髓(sui)；骨髓(sui)是機(ji)體的(de)造(zao)血組(zu)織(zhi)，位於身體的(de)許(xu)多骨骼(ge)內(nei)。成年(nian)動(dong)物的骨髓(sui)分(fen)兩(liang)種(zhong)：紅(hong)骨髓(sui)和(he)黃(huang)骨髓(sui)。紅骨髓(sui)能制(zhi)造(zao)紅細(xi)胞(bao)、血小(xiao)板和(he)各種(zhong)白(bai)細(xi)胞。血小板有止血作(zuo)用(yong)，白細胞能(neng)殺(sha)滅(mie)與抑(yi)制(zhi)各種(zhong)病(bing)原(yuan)體，包(bao)括(kuo)細菌(jun)、病毒等(deng)；某些淋(lin)巴細(xi)胞能(neng)制(zhi)造(zao)抗體。因(yin)此，骨髓(sui)不(bu)但是造(zao)血器官(guan)，它還(hai)是(shi)重要(yao)的免(mian)疫(yi)器官(guan)。骨髓(sui)是存(cun)在(zai)於長(chang)骨（如(ru)肱(gong)骨、股(gu)骨）的(de)骨髓(sui)腔和(he)扁(bian)平(ping)骨（如(ru)髂(qia)骨）的(de)稀(xi)松(song)骨質間(jian)的(de)網(wang)眼(yan)中，是(shi)壹(yi)種(zhong)海綿(mian)狀(zhuang)的(de)組(zu)織(zhi)，能產生(sheng)血(xue)細(xi)胞的(de)骨髓(sui)略(lve)呈(cheng)紅色(se)，稱為(wei)紅(hong)骨髓(sui)。出生(sheng)時，紅(hong)骨髓(sui)充滿(man)全身(shen)骨髓(sui)腔，隨著年齡(ling)增大(da)，脂肪細胞(bao)增多(duo)，相當(dang)部分(fen)紅(hong)骨髓(sui)被黃(huang)骨髓(sui)取代，最(zui)後幾(ji)乎(hu)只有扁(bian)平(ping)骨骨髓(sui)腔中有紅(hong)骨髓(sui)。骨髓(sui)基(ji)質系(xi)統(tong)內(nei)存(cun)在(zai)的骨髓(sui)間充質幹(gan)細(xi)胞(bao)是(shi)壹(yi)種(zhong)除(chu)造(zao)血幹(gan)細(xi)胞(bao)以(yi)外(wai)的(de)、具有高(gao)度自(zi)我(wo)更新(xin)能(neng)力(li)和(he)多(duo)向(xiang)分(fen)化(hua)潛(qian)能的(de)幹(gan)細(xi)胞(bao)，可(ke)以(yi)向(xiang)骨、軟(ruan)骨、肌組織、皮膚(fu)、脂(zhi)肪、神經(jing)等(deng)多(duo)種(zhong)組(zu)織(zhi)分(fen)化(hua)，因(yin)此可(ke)以(yi)作(zuo)為(wei)組(zu)織工程(cheng)中的(de)種(zhong)子(zi)細(xi)胞。在(zai)骨髓(sui)中，BMSC占骨髓(sui)有核(he)細(xi)胞(bao)總數(shu)的0.001%-0.1%，含(han)量極低(di)。骨髓(sui)間充質幹(gan)細(xi)胞(bao)的(de)體外(wai)培(pei)養(yang)條(tiao)件要(yao)求(qiu)較(jiao)高(gao)，在(zai)培(pei)養(yang)過(guo)程(cheng)中，受(shou)貼(tie)壁(bi)時(shi)間、種(zhong)植密(mi)度、血清含(han)量、培(pei)養(yang)溫度和(he)培(pei)養(yang)基(ji)pH值等(deng)條(tiao)件的(de)影(ying)響(xiang)。
方法簡(jian)介(jie)：

公(gong)司實驗(yan)室分(fen)離(li)的兔骨髓(sui)間充質幹(gan)采(cai)用沖(chong)洗(xi)骨髓(sui)、密(mi)度梯度離心、差速(su)貼(tie)壁(bi)法結(jie)合培(pei)養(yang)基(ji)篩(shai)選制備(bei)而來，細胞總量約為(wei)5×10?cells/瓶(ping)。
質量檢測：

公(gong)司實驗(yan)室分(fen)離(li)的兔骨髓(sui)間充質幹(gan)經(jing)CD90免(mian)疫(yi)熒(ying)光鑒定，純度可(ke)達90%以(yi)上(shang)，且(qie)不(bu)含(han)有HIV-1、HBV、HCV、支原(yuan)體、細(xi)菌(jun)、酵母(mu)和(he)真(zhen)菌(jun)等(deng)。

壹(yi)、細胞(bao)培(pei)養(yang)

1取(qu)材(cai) 在(zai)無(wu)菌(jun)環(huan)境下從機體取(qu)出(chu)某種(zhong)組(zu)織(zhi)細胞（視實驗(yan)目的而(er)定(ding)），經過(guo)壹(yi)定的(de)處(chu)理（如(ru)消(xiao)化(hua)分(fen)散(san)細(xi)胞(bao)、分(fen)離(li)等(deng)）後(hou)接(jie)入(ru)培(pei)養(yang)器血(xue)中，這(zhe)壹(yi)過程(cheng)稱為(wei)取(qu)材。如是(shi)細(xi)胞株的(de)擴(kuo)大(da)培(pei)養(yang)則(ze)無(wu)取材(cai)這壹(yi)過程(cheng)。機體取(qu)出(chu)的組(zu)織細胞的(de)培(pei)養(yang)稱(cheng)為(wei)原(yuan)代培(pei)養(yang)。2培(pei)養(yang) 將(jiang)取(qu)得的(de)組(zu)織細(xi)胞接入(ru)培(pei)養(yang)瓶(ping)或培(pei)養(yang)板中的(de)過程稱為(wei)培(pei)養(yang)。3凍(dong)存及復(fu)蘇（可(ke)參閱(yue)後面有關(guan)章(zhang)節(jie)）為(wei)了(le)保存(cun)細胞，特別是不(bu)易獲(huo)得的(de)突(tu)變型(xing)細胞或細胞(bao)株，要(yao)將細(xi)胞凍(dong)存。凍(dong)存的溫度壹(yi)般用(yong)液氮的(de)溫度－196℃，將細胞收(shou)集至(zhi)凍(dong)存管中加(jia)入(ru)含(han)保護(hu)劑(ji)（壹(yi)般為(wei)二(er)甲(jia)亞碸或甘(gan)油）的(de)培(pei)養(yang)基(ji)，以(yi)壹(yi)定的(de)冷卻(que)速(su)度凍(dong)存，最終(zhong)保存(cun)於液氮中。在(zai)極低(di)的溫度下，細胞保存(cun)的時間幾(ji)乎(hu)是無(wu)限(xian)的(de)。復(fu)蘇(su)壹(yi)般采(cai)用快(kuai)融(rong)方法，即(ji)從液氮中取(qu)出凍(dong)存管後(hou)，立即(ji)放入(ru)37℃水(shui)中，使(shi)之(zhi)在(zai)壹(yi)分(fen)鐘(zhong)內(nei)迅(xun)速(su)融(rong)解。然(ran)後將細(xi)胞轉入(ru)培(pei)養(yang)器皿中進行(xing)培(pei)養(yang)。

二(er)、原(yuan)代細(xi)胞分(fen)離(li)

凡(fan)是(shi)來源(yuan)於胚(pei)胎(tai)、組(zu)織(zhi)器官(guan)及外(wai)周血，經(jing)特殊分(fen)離(li)方法制(zhi)備(bei)而來的原(yuan)初培(pei)養(yang)的(de)細(xi)胞稱之(zhi)為(wei)原(yuan)代細(xi)胞。1懸(xuan)浮(fu)細胞(bao)的(de)分(fen)離(li)方法組(zu)織(zhi)材(cai)料(liao)若來自(zi)血(xue)液(ye)、羊(yang)水(shui)、胸(xiong)水(shui)或腹水(shui)的(de)懸(xuan)液材(cai)料(liao)，的(de)方法是(shi)采(cai)用1000r/min的(de)低(di)速離(li)心(xin)10分(fen)鐘(zhong)。經(jing)離(li)心(xin)後由於各種(zhong)細(xi)胞(bao)的比重不(bu)同(tong)可(ke)在(zai)分(fen)層(ceng)液中形(xing)成不(bu)同(tong)層(ceng)，這(zhe)樣可(ke)根據需要(yao)收(shou)獲(huo)目的細(xi)胞(bao)。2實體組(zu)織(zhi)材料(liao)的分(fen)離(li)方法對於實體組(zu)織(zhi)材料(liao)，由於細胞間結(jie)合緊密(mi)，為(wei)了(le)使組織(zhi)中的(de)細胞充分(fen)分(fen)散(san)，形(xing)成細胞(bao)懸(xuan)液，可(ke)采(cai)用機(ji)械(xie)分(fen)散(san)法（物(wu)理裂(lie)解）和(he)消(xiao)化(hua)分(fen)離(li)法。

三、細(xi)胞增殖檢(jian)測(ce)技(ji)術(shu)

目前主(zhu)要(yao)有兩(liang)種(zhong)用(yong)於檢測細胞(bao)增殖能(neng)力(li)的方法。壹(yi)種(zhong)是(shi)直接的方法，通(tong)過(guo)直接測定(ding)進行(xing)分(fen)裂(lie)

的(de)細(xi)胞數(shu)來評(ping)價(jia)細(xi)胞(bao)的增殖能(neng)力(li)。另(ling)壹(yi)種(zhong)是(shi)間(jian)接的方法，即(ji)細(xi)胞(bao)活力(li)（cell viability）檢測(ce)方法，通(tong)過(guo)檢(jian)測(ce)樣品中健康(kang)細(xi)胞的數(shu)目來評(ping)價(jia)細(xi)胞(bao)的增殖能(neng)力(li)。顯然(ran)，細胞活力(li)檢測(ce)法並(bing)不(bu)能最終證(zheng)明(ming)檢(jian)測樣品中的(de)細胞是否(fou)在(zai)增殖。如(ru)細(xi)胞在(zai)某壹(yi)培(pei)養(yang)條(tiao)件下(xia)會(hui)自(zi)發(fa)啟動(dong)雕亡(wang)程(cheng)序(xu)，但藥物(wu)的幹(gan)擾(rao)可(ke)抑(yi)制(zhi)雕(diao)亡(wang)的(de)發(fa)生；這(zhe)時若(ruo)采(cai)用細(xi)胞(bao)活力(li)檢測(ce)法，顯然(ran)可(ke)以(yi)區(qu)分(fen)兩(liang)種(zhong)條(tiao)件下(xia)的(de)細(xi)胞(bao)數(shu)量，但我(wo)們並(bing)不(bu)能從藥物(wu)幹(gan)擾(rao)組(zu)細(xi)胞數(shu)大(da)於對照組的(de)事(shi)實說(shuo)明(ming)藥物(wu)可(ke)促進細(xi)胞(bao)增殖的(de)結(jie)論。所(suo)以(yi)最(zui)直接的證(zheng)據應(ying)該采(cai)用方法壹(yi)。

取(qu)材(cai)：首先(xian)，用培(pei)養(yang)液(ye)濕(shi)潤(run)所(suo)取的(de)組織材料，並(bing)用鋒(feng)利(li)的(de)眼(yan)科剪去除(chu)附在(zai)其上(shang)的脂(zhi)肪和(he)結(jie)締(di)組織(zhi)。接著用平(ping)衡液(ye)（如(ru)PBS或Hanks液）漂(piao)洗，再用(yong)眼(yan)科彎剪將(jiang)組(zu)織塊(kuai)剪成(cheng)小(xiao)塊(kuai)。多次(ci)用(yong)PBS或Hanks液漂(piao)洗，直到液體清亮、無(wu)油滴(di)為(wei)止。

接(jie)種(zhong)：用(yong)濕(shi)潤(run)的(de)吸(xi)管吸(xi)取切碎的(de)組(zu)織塊(kuai)，輕(qing)輕(qing)吹到(dao)培(pei)養(yang)瓶(ping)皿中，並(bing)按(an)壹(yi)定間(jian)距(ju)均(jun)勻(yun)放在(zai)培(pei)養(yang)瓶(ping)底(di)壁(bi)上(shang)。註意(yi)不(bu)要(yao)過多(duo)，確(que)保組(zu)織塊(kuai)切面貼(tie)在(zai)培(pei)養(yang)瓶(ping)底(di)壁(bi)上(shang)。

培(pei)養(yang)：將(jiang)培(pei)養(yang)瓶(ping)翻轉，使(shi)瓶(ping)底(di)朝(chao)上(shang)，在(zai)種(zhong)植了(le)組織(zhi)塊(kuai)壹(yi)側的(de)對側(ce)面加(jia)足培(pei)養(yang)液(ye)，避免(mian)組(zu)織塊(kuai)與培(pei)養(yang)液(ye)接(jie)觸，然(ran)後塞(sai)緊瓶(ping)塞(sai)。將種(zhong)植了(le)組織(zhi)塊(kuai)的壹(yi)側朝(chao)上(shang)，靜置於37℃培(pei)養(yang)箱中。待(dai)組織塊(kuai)貼(tie)壁(bi)1到(dao)3小時後翻瓶(ping)，使(shi)貼(tie)壁(bi)的(de)組織塊(kuai)浸沒(mei)在(zai)培(pei)養(yang)液(ye)中，繼續靜(jing)置。換液：每(mei)隔2到3天(tian)更換壹(yi)次培(pei)養(yang)液(ye)，或者(zhe)根據培(pei)養(yang)瓶(ping)種(zhong)顏(yan)色(se)的變(bian)化(hua)確(que)定(ding)換液時間(jian)。

壹(yi)、原(yuan)代細(xi)胞計(ji)數(shu)

將(jiang)血(xue)球(qiu)計(ji)數(shu)板及蓋(gai)片用擦試(shi)幹(gan)凈(jing)，並(bing)將蓋(gai)片蓋(gai)在(zai)計數(shu)板上(shang)。

將(jiang)細(xi)胞懸(xuan)液吸(xi)出少(shao)許，滴(di)加(jia)在(zai)蓋(gai)片邊(bian)緣，使懸(xuan)液充滿(man)蓋(gai)片和(he)計(ji)數(shu)板之(zhi)間。

靜(jing)置3分(fen)鐘(zhong)。

鏡下觀(guan)察，計(ji)算(suan)計數(shu)板四(si)大(da)格細胞(bao)總數(shu)，壓(ya)線(xian)細胞只計左側和(he)上(shang)方的。然(ran)後按(an)下式(shi)計算(suan)：

細(xi)胞(bao)數(shu)/ml＝4大(da)格細胞(bao)總數(shu)/ 4×10000

註意(yi)：鏡下偶(ou)見由兩個(ge)以(yi)上(shang)細胞(bao)組成的細胞團(tuan)，應(ying)按(an)單個(ge)細(xi)胞(bao)計(ji)算(suan)，若細(xi)胞團占10%以(yi)上(shang)，說明(ming)分(fen)散(san)不(bu)好，需重新(xin)制(zhi)備(bei)細胞懸(xuan)液。

二(er)、原(yuan)代細(xi)胞活力(li)

將(jiang)細(xi)胞懸(xuan)液以(yi)0.5ml加(jia)入(ru)試(shi)管(guan)中。

加(jia)入(ru)0.5ml 0.4%臺(tai)盼蘭(lan)染(ran)液(ye)，染(ran)色(se)2壹(yi)3分(fen)鐘(zhong)。

吸(xi)取少(shao)許懸(xuan)液塗(tu)於載玻(bo)片上(shang)，加(jia)上(shang)蓋(gai)片。

鏡下取幾(ji)個(ge)任意(yi)視野(ye)分(fen)別計死(si)細胞(bao)和(he)活細胞數(shu)，計細(xi)胞活力(li)。

死(si)細(xi)胞能(neng)被臺(tai)盼蘭(lan)染(ran)上(shang)色(se)，鏡下可(ke)見深(shen)蘭(lan)色(se)的細(xi)胞(bao)，活細胞不(bu)被染(ran)色(se)，鏡下呈(cheng)無(wu)色(se)透明(ming)狀(zhuang)。

活力(li)測定(ding)可(ke)以(yi)和(he)細(xi)胞(bao)計數(shu)合起來進行(xing)，但要(yao)考慮(lv)到染(ran)液(ye)對原(yuan)細胞懸(xuan)液的(de)加(jia)倍稀釋作(zuo)用(yong)。