【概(gai)要描述】兔肺(fei)成纖維細(xi)胞(bao)的(de)相(xiang)關產品(pin)：NCI-H292-LUC-EGFP人(ren)肺(fei)癌(ai)細胞(bao)大鼠(shu)原(yuan)代(dai)腸(chang)道(dao)幹細(xi)胞人(ren)原(yuan)代(dai)胰(yi)腺(xian)成纖維細(xi)胞(bao)小(xiao)鼠原(yuan)代(dai)卵(luan)泡(pao)膜細(xi)胞大鼠(shu)原(yuan)代(dai)腎(shen)集(ji)合管(guan)上皮細胞小(xiao)鼠原(yuan)代(dai)胰(yi)腺(xian)腺泡(pao)細胞(bao)山(shan)羊原(yuan)代(dai)卵(luan)巢(chao)顆(ke)粒(li)細(xi)胞(bao)小(xiao)鼠(shu)原(yuan)代(dai)脊(ji)髓(sui)神經元細(xi)胞(bao)小鼠原(yuan)代(dai)結(jie)腸成(cheng)纖維細(xi)胞(bao)人(ren)原(yuan)代(dai)食管(guan)成纖維細(xi)胞(bao)

兔肺(fei)成纖維細(xi)胞(bao)

培養(yang)基(ji) 含(han)FBS、生長(chang)添加劑、Penicillin、Streptomycin等(deng)

換(huan)液頻(pin)率 每(mei)2-3天(tian)換液(ye)壹(yi)次

生長(chang)特性 貼(tie)壁

細(xi)胞形(xing)態(tai) 成(cheng)纖維細(xi)胞(bao)樣(yang)

傳(chuan)代(dai)特性 可(ke)傳(chuan)5代(dai)左(zuo)右；3代(dai)以內(nei)狀態(tai)

消(xiao)化液(ye) 0.25%yi蛋(dan)白(bai)酶(mei)

培養(yang)條件 氣(qi)相(xiang)：空(kong)氣(qi)，95%；CO2，5%

兔肺(fei)成纖維分(fen)離自肺(fei)組織；肺(fei)是機體(ti)的(de)呼(hu)吸器官(guan)，位(wei)於胸(xiong)腔(qiang)，左(zuo)右各(ge)壹(yi)，覆(fu)蓋於心之(zhi)上(shang)。肺(fei)有(you)分(fen)葉(ye)，左(zuo)二(er)右三(san)，共五(wu)葉(ye)。肺(fei)經肺(fei)系（指氣(qi)管、支氣(qi)管等(deng)）與(yu)喉、鼻(bi)相(xiang)連(lian)，故(gu)稱喉為肺(fei)之(zhi)門(men)戶(hu)，鼻(bi)為肺(fei)之(zhi)外(wai)竅(qiao)。成(cheng)纖維細(xi)胞(bao)（Fibroblast）是(shi)疏松(song)結(jie)締(di)組織的(de)主要(yao)細胞(bao)成分(fen)，由(you)胚胎(tai)時期的(de)間(jian)充(chong)質(zhi)細(xi)胞分(fen)化(hua)而(er)來(lai)；成(cheng)纖維細(xi)胞(bao)較(jiao)大，輪(lun)廓(kuo)清(qing)楚，多為突(tu)起的紡錘形(xing)或星形的扁(bian)平(ping)狀結(jie)構(gou)，其(qi)細胞(bao)核呈(cheng)規(gui)則(ze)的卵(luan)圓(yuan)形，核仁大而(er)明(ming)顯(xian)。成纖維細(xi)胞(bao)功(gong)能(neng)活(huo)動旺盛，細(xi)胞(bao)質(zhi)嗜(shi)弱堿性，具(ju)明(ming)顯(xian)的蛋(dan)白(bai)質(zhi)合(he)成和分(fen)泌活(huo)動，在(zai)壹(yi)定(ding)條件下(xia)，它可(ke)以實現跟(gen)纖維細(xi)胞(bao)的(de)互(hu)相(xiang)轉(zhuan)化；成(cheng)纖維細(xi)胞(bao)對(dui)不(bu)同程度(du)的(de)細(xi)胞(bao)變(bian)性、壞死(si)和(he)組織缺損的(de)修復(fu)有(you)著(zhe)十(shi)分(fen)重(zhong)要(yao)的(de)作用。剛(gang)分(fen)離的肺(fei)成纖維細(xi)胞(bao)呈(cheng)圓(yuan)形、折(zhe)光性良好(hao)，懸(xuan)浮於培養(yang)基(ji)中。30min細(xi)胞貼(tie)壁，其(qi)中部(bu)分(fen)開(kai)始(shi)伸(shen)出(chu)偽足，表現為小(xiao)的突起；6h後細(xi)胞基本(ben)貼(tie)壁wan全(quan)，伸(shen)展(zhan)成梭(suo)形(xing)，胞(bao)核清(qing)晰，分(fen)布(bu)較(jiao)均(jun)勻，散在生長(chang)，不(bu)聚集(ji)成(cheng)團(tuan)；細(xi)胞(bao)生長(chang)迅速，5-7天(tian)即呈(cheng)融合(he)狀態(tai)，細(xi)胞(bao)排列緊(jin)密，有(you)的交(jiao)叉重(zhong)疊(die)生長(chang)，平(ping)坦(tan)、胞(bao)體(ti)較(jiao)大，細(xi)胞(bao)質(zhi)透明(ming)，細(xi)胞核較(jiao)大，呈(cheng)橢(tuo)圓(yuan)形，顏(yan)色(se)淡。細胞(bao)融(rong)合(he)，並彼此連(lian)接(jie)成網狀；細(xi)胞(bao)呈(cheng)突起(qi)的紡錘形或星形的扁(bian)平(ping)分(fen)布(bu)。肺(fei)成纖維細(xi)胞(bao)在(zai)生理(li)條件下(xia)的(de)主要(yao)功能(neng)包(bao)括：構(gou)造(zao)和(he)維持(chi)肺(fei)器官(guan)的正常形態(tai)，合(he)成(cheng)和釋(shi)放(fang)細胞(bao)外(wai)基(ji)質(zhi)以及組織損傷後及時大量(liang)聚(ju)集(ji)修復(fu)損傷組織。
方(fang)法簡(jian)介(jie)：

公(gong)司(si)實驗室(shi)分(fen)離的兔肺(fei)成纖維采用yi蛋(dan)白(bai)酶(mei)-膠原(yuan)酶(mei)混合消(xiao)化法結(jie)合差(cha)速貼(tie)壁法制(zhi)備(bei)而(er)來(lai)，細(xi)胞(bao)總(zong)量約為5×10?cells/瓶(ping)。
質(zhi)量(liang)檢測：

公(gong)司(si)實驗室(shi)分(fen)離的兔肺(fei)成纖維經Vimentin免(mian)疫熒(ying)光鑒定(ding)，純度(du)可(ke)達(da)90%以上，且不(bu)含有(you)HIV-1、HBV、HCV、支原(yuan)體(ti)、細(xi)菌(jun)、酵(jiao)母和真(zhen)菌(jun)等(deng)。

壹(yi)、細胞培養(yang)

1取(qu)材(cai) 在(zai)無(wu)菌(jun)環境下(xia)從(cong)機體(ti)取(qu)出(chu)某種(zhong)組織細(xi)胞(bao)（視實驗目(mu)的而(er)定(ding)），經過壹(yi)定(ding)的處理(li)（如消(xiao)化分(fen)散細胞(bao)、分(fen)離等(deng)）後(hou)接入(ru)培養(yang)器(qi)血中(zhong)，這壹(yi)過程稱為取(qu)材(cai)。如是細(xi)胞(bao)株(zhu)的(de)擴(kuo)大培養(yang)則(ze)無取(qu)材(cai)這(zhe)壹(yi)過程。機體(ti)取(qu)出(chu)的組織細(xi)胞(bao)的培養(yang)稱(cheng)為原(yuan)代(dai)培養(yang)。2培養(yang) 將(jiang)取(qu)得(de)的(de)組織細(xi)胞(bao)接入(ru)培養(yang)瓶(ping)或培養(yang)板(ban)中的過(guo)程稱為培養(yang)。3凍存(cun)及復(fu)蘇(su)（可參閱後(hou)面有(you)關章節(jie)）為了(le)保(bao)存(cun)細胞，特別(bie)是不(bu)易獲(huo)得(de)的(de)突(tu)變(bian)型細胞(bao)或細胞株，要(yao)將(jiang)細胞(bao)凍存(cun)。凍存(cun)的溫度(du)壹(yi)般用液氮的(de)溫(wen)度(du)－196℃，將(jiang)細(xi)胞(bao)收(shou)集至凍存(cun)管中加入(ru)含保(bao)護(hu)劑（壹(yi)般為二(er)甲(jia)亞(ya)碸或甘油）的(de)培養(yang)基(ji)，以壹(yi)定(ding)的冷(leng)卻(que)速度(du)凍存(cun)，最終保(bao)存(cun)於液氮中(zhong)。在(zai)極(ji)低(di)的溫(wen)度(du)下(xia)，細(xi)胞(bao)保(bao)存(cun)的時間幾(ji)乎是(shi)無(wu)限的。復(fu)蘇(su)壹(yi)般采用快(kuai)融方(fang)法，即從液氮中(zhong)取(qu)出(chu)凍存(cun)管後，立即放入(ru)37℃水中，使(shi)之(zhi)在(zai)壹(yi)分(fen)鐘(zhong)內(nei)迅速融(rong)解。然(ran)後將(jiang)細(xi)胞(bao)轉(zhuan)入(ru)培養(yang)器(qi)皿中進行培養(yang)。

二(er)、原(yuan)代(dai)細(xi)胞(bao)分(fen)離

凡是來(lai)源於胚胎(tai)、組織器(qi)官(guan)及外周血，經特殊分(fen)離方(fang)法制(zhi)備(bei)而(er)來(lai)的(de)原(yuan)初(chu)培養(yang)的(de)細胞(bao)稱之(zhi)為原(yuan)代(dai)細(xi)胞(bao)。1懸(xuan)浮細(xi)胞(bao)的分(fen)離方(fang)法組織材(cai)料(liao)若來(lai)自血液(ye)、羊(yang)水、胸(xiong)水或腹水的懸(xuan)液材(cai)料(liao)，的(de)方(fang)法是采用1000r/min的(de)低(di)速離心10分(fen)鐘(zhong)。經離心後(hou)由(you)於各種細胞(bao)的(de)比重(zhong)不(bu)同可在分(fen)層(ceng)液中(zhong)形成(cheng)不(bu)同層(ceng)，這樣(yang)可根(gen)據需要收(shou)獲(huo)目(mu)的細(xi)胞。2實體組織材(cai)料(liao)的(de)分(fen)離方(fang)法對(dui)於實體組織材(cai)料(liao)，由(you)於細胞間結(jie)合緊(jin)密，為了(le)使(shi)組織中(zhong)的(de)細胞充(chong)分(fen)分(fen)散，形成(cheng)細胞(bao)懸(xuan)液，可(ke)采用機械(xie)分(fen)散法（物理(li)裂解(jie)）和(he)消(xiao)化分(fen)離法。

三(san)、細胞(bao)增(zeng)殖(zhi)檢測(ce)技(ji)術

目(mu)前(qian)主要(yao)有(you)兩(liang)種用(yong)於檢測細胞(bao)增(zeng)殖(zhi)能(neng)力(li)的(de)方(fang)法。壹(yi)種是直接的方(fang)法，通過直接(jie)測(ce)定(ding)進行分(fen)裂

的(de)細胞(bao)數(shu)來(lai)評(ping)價細(xi)胞(bao)的增(zeng)殖(zhi)能(neng)力(li)。另(ling)壹(yi)種是間接的方(fang)法，即細胞活(huo)力（cell viability）檢(jian)測(ce)方(fang)法，通過檢測(ce)樣(yang)品(pin)中(zhong)健(jian)康細胞(bao)的數(shu)目(mu)來(lai)評(ping)價細(xi)胞(bao)的增(zeng)殖(zhi)能(neng)力(li)。顯(xian)然(ran)，細胞(bao)活(huo)力檢(jian)測(ce)法並不(bu)能(neng)最(zui)終(zhong)證(zheng)明(ming)檢(jian)測樣品(pin)中(zhong)的(de)細(xi)胞(bao)是否在增(zeng)殖(zhi)。如細胞(bao)在(zai)某(mou)壹(yi)培養(yang)條件下(xia)會自發啟動雕亡程序，但藥(yao)物的幹擾(rao)可抑(yi)制(zhi)雕亡的(de)發生；這(zhe)時若采用細(xi)胞活(huo)力檢(jian)測(ce)法，顯然(ran)可以區(qu)分(fen)兩(liang)種條件下(xia)的(de)細(xi)胞(bao)數量，但我們(men)並不(bu)能(neng)從(cong)藥(yao)物幹擾(rao)組細胞(bao)數(shu)大於對(dui)照(zhao)組的事(shi)實說(shuo)明(ming)藥(yao)物可促進(jin)細(xi)胞(bao)增殖(zhi)的結(jie)論。所以最直(zhi)接的證(zheng)據(ju)應(ying)該(gai)采用方(fang)法壹(yi)。

取(qu)材(cai)：首(shou)先(xian)，用(yong)培養(yang)液(ye)濕潤所取(qu)的(de)組織材(cai)料(liao)，並用鋒(feng)利的眼科剪去除附(fu)在其(qi)上的(de)脂(zhi)肪和結(jie)締(di)組織。接(jie)著(zhe)用(yong)平(ping)衡(heng)液（如PBS或Hanks液）漂(piao)洗，再(zai)用眼科彎剪將(jiang)組織塊(kuai)剪(jian)成小塊(kuai)。多次用(yong)PBS或Hanks液漂(piao)洗，直(zhi)到液(ye)體清(qing)亮、無油滴(di)為止。

接(jie)種：用(yong)濕(shi)潤的吸(xi)管(guan)吸(xi)取(qu)切(qie)碎的組織塊(kuai)，輕(qing)輕吹到(dao)培養(yang)瓶(ping)皿中，並按壹(yi)定(ding)間距(ju)均(jun)勻放(fang)在培養(yang)瓶(ping)底壁(bi)上。註意不(bu)要過(guo)多，確保(bao)組織塊(kuai)切(qie)面貼(tie)在培養(yang)瓶(ping)底壁(bi)上。

培養(yang)：將(jiang)培養(yang)瓶(ping)翻轉(zhuan)，使(shi)瓶底朝上，在(zai)種(zhong)植了(le)組織塊(kuai)壹(yi)側的對(dui)側面加足培養(yang)液(ye)，避(bi)免組織塊(kuai)與(yu)培養(yang)液(ye)接觸，然(ran)後塞緊(jin)瓶塞。將(jiang)種植了(le)組織塊(kuai)的(de)壹(yi)側朝上，靜置(zhi)於37℃培養(yang)箱(xiang)中。待(dai)組織塊(kuai)貼(tie)壁1到(dao)3小(xiao)時(shi)後翻瓶，使(shi)貼(tie)壁的(de)組織塊(kuai)浸沒(mei)在培養(yang)液(ye)中，繼(ji)續(xu)靜置(zhi)。換液(ye)：每隔(ge)2到(dao)3天(tian)更(geng)換壹(yi)次培養(yang)液(ye)，或者根據培養(yang)瓶(ping)種顏(yan)色(se)的變(bian)化確(que)定(ding)換液(ye)時(shi)間。

壹(yi)、原代(dai)細(xi)胞(bao)計數

將(jiang)血球(qiu)計數板(ban)及蓋片(pian)用擦試幹(gan)凈，並將蓋(gai)片(pian)蓋在計數板(ban)上。

將(jiang)細胞(bao)懸(xuan)液吸(xi)出(chu)少許(xu)，滴(di)加在(zai)蓋(gai)片(pian)邊(bian)緣，使(shi)懸(xuan)液充(chong)滿蓋片(pian)和計數板(ban)之(zhi)間(jian)。

靜置(zhi)3分(fen)鐘(zhong)。

鏡(jing)下(xia)觀(guan)察(cha)，計算計數板(ban)四(si)大格(ge)細(xi)胞(bao)總(zong)數，壓(ya)線細胞只計左(zuo)側和上方(fang)的(de)。然(ran)後按下(xia)式(shi)計算：

細(xi)胞數(shu)/ml＝4大格(ge)細(xi)胞(bao)總(zong)數/ 4×10000

註(zhu)意：鏡(jing)下(xia)偶見由兩(liang)個以上細(xi)胞組成的(de)細(xi)胞團(tuan)，應(ying)按單(dan)個(ge)細(xi)胞(bao)計算，若細(xi)胞團(tuan)占(zhan)10%以上，說(shuo)明(ming)分(fen)散不(bu)好(hao)，需重(zhong)新(xin)制(zhi)備(bei)細(xi)胞(bao)懸(xuan)液。

二(er)、原(yuan)代(dai)細(xi)胞(bao)活(huo)力

將(jiang)細胞(bao)懸(xuan)液以0.5ml加入(ru)試管(guan)中。

加入(ru)0.5ml 0.4%臺盼(pan)蘭(lan)染液，染色(se)2壹(yi)3分(fen)鐘(zhong)。

吸(xi)取(qu)少(shao)許(xu)懸(xuan)液塗於載(zai)玻(bo)片(pian)上，加上(shang)蓋(gai)片(pian)。

鏡(jing)下(xia)取(qu)幾(ji)個任意視野分(fen)別(bie)計死(si)細(xi)胞(bao)和(he)活(huo)細胞(bao)數(shu)，計細胞活(huo)力。

死(si)細(xi)胞(bao)能(neng)被(bei)臺(tai)盼(pan)蘭(lan)染上色(se)，鏡下(xia)可(ke)見深蘭(lan)色(se)的細胞(bao)，活(huo)細胞(bao)不(bu)被(bei)染色(se)，鏡下(xia)呈(cheng)無色(se)透明(ming)狀。

活(huo)力測(ce)定(ding)可以和細(xi)胞計數合起來(lai)進(jin)行，但(dan)要考慮到染液對(dui)原(yuan)細(xi)胞(bao)懸(xuan)液的(de)加倍(bei)稀(xi)釋(shi)作用。