【概要(yao)描述(shu)】兔(tu)視網(wang)膜色素(su)上皮細(xi)胞(bao)的相(xiang)關(guan)產(chan)品(pin)：A549+GFP+LUC人(ren)非(fei)小細(xi)胞(bao)大鼠原代小腸(chang)粘膜上(shang)皮細(xi)胞(bao)小鼠原代腸(chang)神(shen)經膠(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)狗(gou)原代皮下微(wei)血(xue)管(guan)內皮細(xi)胞(bao)小鼠原代造(zao)血(xue)幹細(xi)胞(bao)人原代膽(dan)囊成(cheng)纖(xian)維(wei)細(xi)胞(bao)小鼠原代胰腺成(cheng)纖(xian)維(wei)細(xi)胞(bao)兔(tu)原代肌(ji)腱細(xi)胞(bao)羊原代肺微血(xue)管(guan)內皮細(xi)胞(bao)兔(tu)原代滑(hua)膜間(jian)充質(zhi)幹細(xi)胞(bao)

兔(tu)視網(wang)膜色素(su)上皮細(xi)胞(bao)

包(bao)被條(tiao)件(jian) 鼠尾(wei)膠(jiao)原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培(pei)養基(ji) 含FBS、生(sheng)長(chang)添加(jia)劑(ji)、Penicillin、Streptomycin等(deng)

換液(ye)頻率 每2-3天換液(ye)壹(yi)次(ci)

生(sheng)長(chang)特性(xing) 貼壁

細(xi)胞(bao)形態(tai) 上皮細(xi)胞(bao)樣

傳代(dai)特性(xing) 可傳(chuan)2-3代

消化(hua)液 0.25%yi蛋白(bai)酶

培(pei)養條件(jian) 氣(qi)相(xiang)：空(kong)氣(qi)，95%；CO2，5%

兔(tu)視網(wang)膜色素(su)上皮分(fen)離(li)自(zi)視網(wang)膜組織；視(shi)網(wang)膜居(ju)於(yu)眼(yan)球壁的內(nei)層，是壹(yi)層透明(ming)的薄(bo)膜(mo)。視網(wang)膜由色素(su)上皮層和(he)視網(wang)膜感(gan)覺(jiao)層組成(cheng)，兩層間(jian)在病(bing)理(li)情況(kuang)下可分(fen)開，稱(cheng)為(wei)視(shi)網(wang)膜脫(tuo)離(li)。色素(su)上皮層與脈(mai)絡(luo)膜緊(jin)密相(xiang)連，由色素(su)上皮細(xi)胞(bao)組成(cheng)，它們(men)具有(you)支(zhi)持和(he)營養光感(gan)受(shou)器細(xi)胞(bao)、遮光、散(san)熱以(yi)及(ji)再生(sheng)和(he)修(xiu)復等(deng)作(zuo)用。組織學上視網(wang)膜分(fen)為(wei)10層，由外(wai)向(xiang)內分(fen)別(bie)為(wei)：色素(su)上皮層、視錐(zhui)、視桿細(xi)胞(bao)層、外界(jie)膜(mo)、外顆(ke)粒層、外叢狀層、內顆(ke)粒層、內叢狀層、神(shen)經節(jie)細(xi)胞(bao)層、神(shen)經纖(xian)維(wei)層、內界(jie)膜(mo)。視網(wang)膜內(nei)層為(wei)襯(chen)於血(xue)管(guan)膜內面的壹(yi)層薄膜，有(you)感(gan)光作(zuo)用；後(hou)部鼻側有(you)壹(yi)視(shi)神(shen)經乳(ru)頭。視(shi)網(wang)膜上(shang)的感(gan)覺(jiao)層是由三(san)個(ge)神(shen)經元(yuan)組成(cheng)。神(shen)經元(yuan)是視(shi)細(xi)胞(bao)層，專(zhuan)司感(gan)光，它包(bao)括錐(zhui)細(xi)胞(bao)和(he)桿細(xi)胞(bao)。視桿細(xi)胞(bao)主要(yao)在離(li)中心凹較遠的視(shi)網(wang)膜上(shang)，而(er)視(shi)錐(zhui)細(xi)胞(bao)則在中心凹處(chu)最多(duo)。第(di)二(er)層叫雙節(jie)細(xi)胞(bao)，約(yue)有(you)10到(dao)數(shu)百個(ge)視(shi)細(xi)胞(bao)通過(guo)雙(shuang)節(jie)細(xi)胞(bao)與壹(yi)個(ge)神(shen)經節(jie)細(xi)胞(bao)相(xiang)聯系(xi)，負(fu)責(ze)聯絡(luo)作(zuo)用。第(di)三(san)層叫節(jie)細(xi)胞(bao)層，專(zhuan)管傳(chuan)導。視網(wang)膜是(shi)壹(yi)層菲薄的但(dan)又(you)非常復雜的結(jie)構，它貼於眼(yan)球的後(hou)壁部，傳遞來(lai)自(zi)視網(wang)膜感(gan)受(shou)器沖(chong)動的神(shen)經纖(xian)維(wei)跨越視(shi)網(wang)膜表(biao)面，經由視(shi)神(shen)經到(dao)達(da)出(chu)口。視(shi)網(wang)膜的分(fen)辨(bian)力是(shi)不(bu)均(jun)勻(yun)的，在(zai)黃(huang)斑區(qu)，其分(fen)辨(bian)能力(li)強(qiang)。視(shi)網(wang)膜色素(su)上皮（RPE）位(wei)於脈(mai)絡(luo)膜和(he)光感(gan)受(shou)器細(xi)胞(bao)外節(jie)之(zhi)間(jian)，是視(shi)網(wang)膜下腔(qiang)和(he)脈(mai)絡(luo)膜血(xue)管(guan)之(zhi)間(jian)的離(li)子(zi)、水(shui)、營養物質(zhi)和(he)代謝終(zhong)產(chan)物轉(zhuan)運通道(dao)；主(zhu)要是(shi)由單(dan)層色素(su)上皮細(xi)胞(bao)所構成(cheng)，排列十分(fen)規(gui)則。視網(wang)膜色素(su)上皮參(can)與shi黃醇(chun)循環，吞噬脫落(luo)的光感(gan)受(shou)器細(xi)胞(bao)外節(jie)以(yi)維(wei)持光感(gan)受(shou)器細(xi)胞(bao)興奮(fen)性，並(bing)分(fen)泌(mi)多(duo)種生(sheng)長(chang)因子(zi)，幫(bang)助(zhu)維(wei)持脈(mai)絡(luo)膜血(xue)管(guan)內皮細(xi)胞(bao)和(he)光感(gan)受(shou)器細(xi)胞(bao)的結(jie)構完(wan)整性(xing)。細(xi)胞(bao)呈(cheng)多(duo)角(jiao)形，細(xi)胞(bao)分(fen)為(wei)三(san)部分(fen)，即頂部、體部和(he)基(ji)底部。視網(wang)膜色素(su)上皮細(xi)胞(bao)無再生(sheng)能力(li)，細(xi)胞(bao)死亡後(hou)不(bu)被(bei)替(ti)換，而(er)是鄰(lin)近(jin)的細(xi)胞(bao)向(xiang)側面滑(hua)動，以(yi)填(tian)補(bu)死亡細(xi)胞(bao)遺留(liu)下來(lai)的空(kong)間(jian)。視網(wang)膜色素(su)上皮位(wei)於脈(mai)絡(luo)膜和(he)光感(gan)受(shou)器細(xi)胞(bao)外節(jie)之(zhi)間(jian)，是視(shi)網(wang)膜下腔(qiang)和(he)脈(mai)絡(luo)膜血(xue)管(guan)之(zhi)間(jian)的離(li)子(zi)、水(shui)、營養物質(zhi)和(he)代謝終(zhong)產(chan)物轉(zhuan)運通道(dao)。視(shi)網(wang)膜色素(su)上皮參(can)與shi黃醇(chun)循環，吞噬脫落(luo)的光感(gan)受(shou)器細(xi)胞(bao)外節(jie)以(yi)維(wei)持光感(gan)受(shou)器細(xi)胞(bao)興奮(fen)性，並(bing)分(fen)泌(mi)多(duo)種生(sheng)長(chang)因子(zi)，幫(bang)助(zhu)維(wei)持脈(mai)絡(luo)膜血(xue)管(guan)內皮細(xi)胞(bao)和(he)光感(gan)受(shou)器細(xi)胞(bao)的結(jie)構完(wan)整性(xing)。
方法簡介：

公司實(shi)驗(yan)室分(fen)離(li)的兔(tu)視網(wang)膜色素(su)上皮采用yi蛋白(bai)酶-膠(jiao)原酶混(hun)合消化(hua)法結(jie)合差速(su)貼壁法，並(bing)通過(guo)上(shang)皮細(xi)胞(bao)專(zhuan)用培(pei)養基(ji)培(pei)養篩選(xuan)制(zhi)備而來(lai)，細(xi)胞(bao)總量(liang)約(yue)為(wei)5×10?cells/瓶(ping)。
質(zhi)量(liang)檢(jian)測(ce)：

公司實(shi)驗(yan)室分(fen)離(li)的兔(tu)視網(wang)膜色素(su)上皮經PCK免疫(yi)熒(ying)光鑒定，純度可達(da)90%以(yi)上(shang)，且不(bu)含(han)有(you)HIV-1、HBV、HCV、支(zhi)原體、細(xi)菌(jun)、酵母和(he)真菌(jun)等(deng)。

壹(yi)、細(xi)胞(bao)培(pei)養

1取材(cai) 在(zai)無菌環境(jing)下從(cong)機(ji)體取出(chu)某(mou)種(zhong)組織細(xi)胞(bao)（視實(shi)驗目(mu)的而(er)定(ding)），經過(guo)壹(yi)定(ding)的處(chu)理（如(ru)消化(hua)分(fen)散(san)細(xi)胞(bao)、分(fen)離(li)等(deng)）後(hou)接(jie)入(ru)培(pei)養器血(xue)中，這壹(yi)過(guo)程(cheng)稱(cheng)為(wei)取材(cai)。如(ru)是細(xi)胞(bao)株(zhu)的擴(kuo)大培(pei)養則無取材(cai)這(zhe)壹(yi)過(guo)程(cheng)。機(ji)體取出(chu)的組織細(xi)胞(bao)的培(pei)養稱為(wei)原代培(pei)養。2培(pei)養 將(jiang)取得(de)的組織細(xi)胞(bao)接(jie)入(ru)培(pei)養瓶或(huo)培(pei)養板中的過(guo)程(cheng)稱(cheng)為(wei)培(pei)養。3凍存及復蘇（可參(can)閱後(hou)面有(you)關(guan)章節(jie)）為(wei)了(le)保存細(xi)胞(bao)，特別(bie)是(shi)不(bu)易(yi)獲(huo)得(de)的突(tu)變型(xing)細(xi)胞(bao)或(huo)細(xi)胞(bao)株(zhu)，要將(jiang)細(xi)胞(bao)凍存。凍存的溫(wen)度壹(yi)般用液(ye)氮(dan)的溫(wen)度－196℃，將(jiang)細(xi)胞(bao)收集(ji)至凍存管中加(jia)入(ru)含保護(hu)劑(ji)（壹(yi)般為(wei)二(er)甲(jia)亞碸或(huo)甘油）的培(pei)養基(ji)，以(yi)壹(yi)定(ding)的冷(leng)卻速(su)度凍(dong)存，最終(zhong)保存於液(ye)氮(dan)中。在極低的溫(wen)度下，細(xi)胞(bao)保存的時間(jian)幾(ji)乎(hu)是無(wu)限的。復蘇壹(yi)般采(cai)用快(kuai)融(rong)方法，即從(cong)液氮(dan)中取出(chu)凍(dong)存管後(hou)，立(li)即放入37℃水(shui)中，使之(zhi)在壹(yi)分(fen)鐘內(nei)迅速(su)融(rong)解(jie)。然後(hou)將(jiang)細(xi)胞(bao)轉入(ru)培(pei)養器皿中進行培(pei)養。

二(er)、原代細(xi)胞(bao)分(fen)離(li)

凡(fan)是(shi)來(lai)源(yuan)於(yu)胚(pei)胎(tai)、組織器官(guan)及(ji)外周(zhou)血(xue)，經特殊分(fen)離(li)方法制(zhi)備而來(lai)的原初培(pei)養的細(xi)胞(bao)稱之(zhi)為(wei)原代細(xi)胞(bao)。1懸(xuan)浮細(xi)胞(bao)的分(fen)離(li)方法組織材(cai)料(liao)若來(lai)自(zi)血(xue)液(ye)、羊水(shui)、胸水(shui)或(huo)腹水(shui)的懸(xuan)液材(cai)料(liao)，的方法是(shi)采用1000r/min的低(di)速(su)離心(xin)10分(fen)鐘。經離(li)心後(hou)由於(yu)各種(zhong)細(xi)胞(bao)的比重(zhong)不(bu)同(tong)可在(zai)分(fen)層液中形成(cheng)不(bu)同(tong)層，這樣可根(gen)據需(xu)要(yao)收獲(huo)目(mu)的細(xi)胞(bao)。2實體組織材(cai)料(liao)的分(fen)離(li)方法對(dui)於(yu)實體組織材(cai)料(liao)，由於(yu)細(xi)胞(bao)間(jian)結(jie)合緊密(mi)，為(wei)了(le)使組織中的細(xi)胞(bao)充分(fen)分(fen)散(san)，形成(cheng)細(xi)胞(bao)懸(xuan)液，可采(cai)用機(ji)械(xie)分(fen)散(san)法（物理(li)裂(lie)解(jie)）和(he)消化(hua)分(fen)離(li)法。

三、細(xi)胞(bao)增殖檢(jian)測(ce)技(ji)術(shu)

目(mu)前(qian)主(zhu)要(yao)有(you)兩(liang)種用於(yu)檢(jian)測(ce)細(xi)胞(bao)增殖能力的方法。壹(yi)種(zhong)是(shi)直接(jie)的方法，通過(guo)直(zhi)接(jie)測(ce)定(ding)進(jin)行分(fen)裂(lie)

的細(xi)胞(bao)數(shu)來(lai)評價細(xi)胞(bao)的增(zeng)殖能力。另壹(yi)種(zhong)是(shi)間(jian)接(jie)的方法，即細(xi)胞(bao)活力(li)（cell viability）檢(jian)測(ce)方法，通過(guo)檢(jian)測(ce)樣品(pin)中健康(kang)細(xi)胞(bao)的數(shu)目(mu)來(lai)評價細(xi)胞(bao)的增(zeng)殖能力。顯(xian)然，細(xi)胞(bao)活力(li)檢(jian)測(ce)法(fa)並(bing)不(bu)能(neng)最(zui)終(zhong)證明(ming)檢(jian)測(ce)樣品(pin)中的細(xi)胞(bao)是否(fou)在增(zeng)殖。如細(xi)胞(bao)在某(mou)壹(yi)培(pei)養條件(jian)下會自(zi)發啟動雕亡程(cheng)序(xu)，但(dan)藥(yao)物的幹擾可抑制(zhi)雕亡的發(fa)生(sheng)；這時若采用細(xi)胞(bao)活力(li)檢(jian)測(ce)法(fa)，顯(xian)然可以(yi)區(qu)分(fen)兩(liang)種條(tiao)件下的細(xi)胞(bao)數(shu)量(liang)，但(dan)我們並(bing)不(bu)能(neng)從(cong)藥物幹擾組細(xi)胞(bao)數(shu)大於對(dui)照(zhao)組的事(shi)實(shi)說(shuo)明(ming)藥物可促進細(xi)胞(bao)增殖的結(jie)論。所(suo)以(yi)最(zui)直(zhi)接(jie)的證據應(ying)該采(cai)用方法壹(yi)。

取材(cai)：首(shou)先(xian)，用培(pei)養液濕(shi)潤(run)所(suo)取的組織材(cai)料(liao)，並(bing)用鋒(feng)利(li)的眼(yan)科(ke)剪(jian)去(qu)除(chu)附(fu)在(zai)其上的脂肪和(he)結(jie)締組織。接(jie)著(zhe)用平衡(heng)液(ye)（如PBS或(huo)Hanks液）漂(piao)洗，再用眼(yan)科(ke)彎(wan)剪(jian)將(jiang)組織塊剪(jian)成(cheng)小塊。多(duo)次用PBS或(huo)Hanks液漂(piao)洗，直到液(ye)體清(qing)亮(liang)、無(wu)油滴(di)為(wei)止(zhi)。

接(jie)種(zhong)：用濕(shi)潤(run)的吸(xi)管(guan)吸取切(qie)碎(sui)的組織塊，輕(qing)輕(qing)吹(chui)到培(pei)養瓶皿中，並(bing)按壹(yi)定(ding)間(jian)距(ju)均(jun)勻(yun)放在(zai)培(pei)養瓶底壁上。註(zhu)意(yi)不(bu)要(yao)過(guo)多(duo)，確保組織塊切(qie)面貼在培(pei)養瓶底壁上。

培(pei)養：將(jiang)培(pei)養瓶翻(fan)轉(zhuan)，使(shi)瓶(ping)底朝(chao)上(shang)，在種(zhong)植(zhi)了組織塊壹(yi)側(ce)的對(dui)側(ce)面加(jia)足(zu)培(pei)養液，避(bi)免組織塊與培(pei)養液接(jie)觸，然後(hou)塞(sai)緊瓶(ping)塞(sai)。將(jiang)種(zhong)植(zhi)了組織塊的壹(yi)側(ce)朝(chao)上，靜置(zhi)於(yu)37℃培(pei)養箱中。待(dai)組織塊貼壁1到3小時後(hou)翻(fan)瓶(ping)，使(shi)貼壁的組織塊浸(jin)沒在培(pei)養液中，繼續靜置(zhi)。換液(ye)：每隔(ge)2到3天更換壹(yi)次(ci)培(pei)養液，或(huo)者(zhe)根(gen)據培(pei)養瓶種(zhong)顏(yan)色的變(bian)化(hua)確定(ding)換液(ye)時間(jian)。

壹(yi)、原代細(xi)胞(bao)計數(shu)

將(jiang)血(xue)球計數(shu)板及(ji)蓋片(pian)用擦(ca)試幹凈，並(bing)將(jiang)蓋片(pian)蓋在(zai)計數(shu)板上(shang)。

將(jiang)細(xi)胞(bao)懸(xuan)液吸(xi)出(chu)少(shao)許(xu)，滴(di)加(jia)在(zai)蓋片(pian)邊(bian)緣，使(shi)懸(xuan)液充滿蓋片(pian)和(he)計數(shu)板之(zhi)間(jian)。

靜置(zhi)3分(fen)鐘。

鏡下觀(guan)察，計算計數(shu)板四(si)大格(ge)細(xi)胞(bao)總數(shu)，壓(ya)線細(xi)胞(bao)只(zhi)計左側和(he)上方的。然(ran)後(hou)按(an)下式(shi)計算：

細(xi)胞(bao)數(shu)/ml＝4大格(ge)細(xi)胞(bao)總數(shu)/ 4×10000

註(zhu)意(yi)：鏡(jing)下偶(ou)見(jian)由兩(liang)個(ge)以(yi)上(shang)細(xi)胞(bao)組成(cheng)的細(xi)胞(bao)團，應(ying)按單(dan)個(ge)細(xi)胞(bao)計算，若細(xi)胞(bao)團占10%以(yi)上(shang)，說(shuo)明(ming)分(fen)散(san)不(bu)好，需(xu)重(zhong)新制(zhi)備細(xi)胞(bao)懸(xuan)液。

二(er)、原代細(xi)胞(bao)活力(li)

將(jiang)細(xi)胞(bao)懸(xuan)液以(yi)0.5ml加(jia)入(ru)試管(guan)中。

加(jia)入(ru)0.5ml 0.4%臺盼(pan)蘭(lan)染液(ye)，染色2壹(yi)3分(fen)鐘。

吸取少(shao)許(xu)懸(xuan)液塗(tu)於(yu)載玻片上，加(jia)上(shang)蓋片(pian)。

鏡下取幾(ji)個(ge)任(ren)意(yi)視(shi)野分(fen)別(bie)計死細(xi)胞(bao)和(he)活細(xi)胞(bao)數(shu)，計細(xi)胞(bao)活力(li)。

死細(xi)胞(bao)能被(bei)臺盼(pan)蘭(lan)染上(shang)色，鏡下可見(jian)深(shen)蘭(lan)色的細(xi)胞(bao)，活細(xi)胞(bao)不(bu)被(bei)染色，鏡下呈(cheng)無(wu)色透明(ming)狀。

活力(li)測(ce)定(ding)可以(yi)和(he)細(xi)胞(bao)計數(shu)合起來(lai)進行，但(dan)要(yao)考慮到(dao)染液(ye)對(dui)原細(xi)胞(bao)懸(xuan)液的加(jia)倍(bei)稀釋(shi)作(zuo)用。