【概(gai)要(yao)描(miao)述(shu)】40%單/雙(shuang)丙(bing)烯(xi)酰胺(an)預制(zhi)膠(jiao)溶液（37.5:） Western免疫印(yin)跡(ji)(Western Blot)是(shi)將(jiang)蛋白(bai)質轉移(yi)到膜(mo)上，然後(hou)利用抗體(ti)進(jin)行檢測。

40%單/雙(shuang)丙(bing)烯(xi)酰胺(an)預制(zhi)膠(jiao)溶液（37.5:） Western Blot技(ji)術(shu): 做線粒體(ti)膜(mo)UCP2蛋白(bai)的(de)Western Blot （以(yi)下簡寫成(cheng)Western Blot），提(ti)取線粒體(ti)後(hou)凍(dong)存(cun)（未(wei)加蛋白(bai)酶抑制(zhi)劑(ji)），樣(yang)品(pin)不能反復凍(dong)融(rong);，加蛋白(bai)酶抑制(zhi)劑(ji)。同時(shi)，建(jian)議檢(jian)查Western Blot過程， 提(ti)高(gao)壹抗濃度。對(dui)於加蛋白(bai)酶抑制(zhi)劑(ji)來(lai)說(shuo)，壹(yi)般(ban)加PMSF就(jiu)可(ke)以(yi)了(le)，能(neng)多(duo)加幾(ji)中(zhong)種(zhong)蛋(dan)白(bai)酶抑制(zhi)劑(ji)。
同壹蛋(dan)白(bai)樣品(pin)能同時(shi)進行(xing)兩(liang)種(zhong)因(yin)子的(de)Western Blot檢測(ce)，有(you)的(de)甚至(zhi)可(ke)以(yi)同時(shi)測幾(ji)十種(zhong)樣(yang)40%單/雙(shuang)丙(bing)烯(xi)酰胺(an)預制(zhi)膠(jiao)溶液（37.5:） 如(ru)果是(shi)膜(mo)蛋白(bai)和胞(bao)漿蛋(dan)白(bai)，所用(yong)的(de)去(qu)垢(gou)劑(ji)就(jiu)要(yao)溫(wen)和得(de)多，這時(shi)加上NaF去(qu)抑制(zhi)磷(lin)#化酶的(de)活性(xing)。
樣品(pin)的(de)蛋白(bai)含(han)量很(hen)低(di)，每(mei)微(wei)升不(bu)到微(wei)克(ke)，但是(shi)在轉膜(mo)時(shi)經常會(hui)發(fa)現只有(you)壹部分(fen)蛋(dan)白(bai)轉到了(le)膜(mo)上，就(jiu)是(shi)在轉膜(mo)後(hou)染(ran)膠(jiao)發(fa)現有(you)的(de)孔所有(you)的(de)蛋白(bai)條(tiao)帶(dai)都(dou)在，只(zhi)是顏色(se)變淡(dan)了(le)，可(ke)以(yi)加大(da)上樣(yang)量(liang)，轉移(yi)時(shi)可(ke)以(yi)用減(jian)少電(dian)流延長(chang)時(shi)間，多加5-0%甲醇。
想分離(li)的(de)蛋白(bai)是分(fen)子量(liang)260kd的(de)，SDS-PAGE電泳(yong)的(de)分離(li)膠(jiao)濃度用6%，Stacking Gel 3.5%，但(dan)260kd的(de)蛋白(bai)不好(hao)做
如(ru)果上(shang)樣量(liang)超(chao)載(zai)，可(ke)以(yi)濃縮(suo)樣品，也(ye)可(ke)以(yi)根據妳(ni)的(de)目(mu)標(biao)分(fen)子量(liang)透析(xi)掉(diao)壹(yi)部分(fen)小分(fen)子蛋(dan)白(bai)。壹般(ban)地，超(chao)載(zai)30%是不會(hui)有(you)問題(ti)的(de)。如(ru)果已(yi)經超(chao)了(le)不(bu)少了(le)，而(er)且小分(fen)子量(liang)的(de)也(ye)要(yao)，可(ke)以(yi)考慮(lv)加大(da)膠(jiao)的(de)厚度，可(ke)以(yi)試(shi)試(shi).5mm的(de) comb。
蛋白(bai)變性(xing)後(hou)存(cun)放-80℃，壹兩(liang)年(nian)沒(mei)有(you)問題(ti)，zui關鍵兩(liang)條(tiao)：不(bu)要(yao)被(bei)蛋白(bai)酶水(shui)解(jie)掉;不(bu)要(yao)被(bei)細(xi)菌(jun)消化掉（也(ye)是被(bei)酶水(shui)解(jie)了(le)）。
采用DAB顯(xian)色(se)技(ji)術(shu)，二抗(kang)是(shi)化的(de)多克(ke)隆抗體(ti)，三(san)抗(kang)是(shi)親和素(su)體(ti)系(xi)，不能使用(yong)脫脂奶(nai)粉(fen)，脫脂奶(nai)粉(fen)會(hui)影(ying)響親(qin)和素(su)的(de)生成(cheng)，因(yin)為(wei)脫脂奶(nai)粉(fen)中(zhong)含(han)，用BSA代(dai)替(ti)應(ying)該(gai)好(hao)壹點(dian) Western Blot壹般(ban)上樣(yang)30-00微(wei)克(ke)不等(deng)，結果跟目(mu)的(de)蛋白(bai)的(de)豐度、上樣(yang)量(liang)、壹二抗(kang)的(de)量和撫(fu)育時(shi)間都(dou)有(you)關系，也(ye)與顯(xian)色(se)時(shi)間長(chang)短有(you)關。開始(shi)摸條(tiao)件時(shi)，為了(le)拿(na)到陽性(xing)結果，各(ge)個步驟都(dou)可(ke)以(yi)量多(duo)壹點時(shi)間長(chang)壹(yi)點，當然背(bei)景(jing)也(ye)就(jiu)出(chu)來(lai)了(le)。要(yao)拿(na)到好(hao)的(de)結果，如(ru)果抗(kang)體(ti)好(hao)的(de)話比較容易(yi)，抗(kang)體(ti)不(bu)好(hao)的(de)話就(jiu)需(xu)要(yao)反復地試(shi)了(le)，當然有(you)的(de)不適(shi)合(he)Western Blot的(de)怎樣(yang)做也(ye)不行(xing)。所以(yi)拿到好(hao)的(de)結果不(bu)容易(yi)。

  壹(yi)、 原理(li)

與(yu)Southern或Northern雜交(jiao)方法(fa)類(lei)似(si)，但(dan)Western Blot采用的(de)是聚丙(bing)烯(xi)酰胺(an)凝膠(jiao)電泳(yong)，被(bei)檢測(ce)物是(shi)蛋白(bai)質，“探(tan)針(zhen)”是(shi)抗體(ti)，“顯(xian)色(se)”用(yong)標(biao)記(ji)的(de)二抗(kang)。經過(guo)PAGE分(fen)離的(de)蛋白(bai)質樣(yang)品，轉移(yi)到固(gu)相載(zai)體(ti)（例(li)如(ru)硝#纖(xian)維素薄(bo)膜(mo)）上(shang)，固相載(zai)體(ti)以(yi)非共(gong)價(jia)鍵形(xing)式(shi)吸附(fu)蛋白(bai)質，且能保持電泳(yong)分離(li)的(de)多肽(tai)類(lei)型(xing)及(ji)其(qi)生(sheng)物(wu)學活性(xing)不變(bian)。以(yi)固相載(zai)體(ti)上(shang)的(de)蛋白(bai)質或多肽(tai)作(zuo)為抗(kang)原，與(yu)對(dui)應的(de)抗體(ti)起(qi)免疫反應，再(zai)與(yu)酶或同位(wei)素(su)標(biao)記(ji)的(de)第(di)二抗(kang)體(ti)起(qi)反應，經過(guo)底物顯(xian)色(se)或放射自(zi)顯(xian)影(ying)以(yi)檢測(ce)電泳分離的(de)特(te)異(yi)性(xing)目(mu)的(de)基(ji)因表達(da)的(de)蛋白(bai)成(cheng)分(fen)。該(gai)技(ji)術(shu)也(ye)廣(guang)泛應(ying)用於(yu)檢測(ce)蛋(dan)白(bai)水平的(de)表達(da)。

二、分(fen)類(lei)  現常用的(de)有(you)底物化學發(fa)光ECL和底物DAB呈(cheng)色，體(ti)同水平和實(shi)驗條(tiao)件的(de)是用(yong)*種(zhong)方法(fa)，目(mu)前(qian)發(fa)表文章通(tong)常是用(yong)底物化學發(fa)光ECL。只(zhi)要(yao)買(mai)現成(cheng)的(de)試(shi)劑(ji)盒(he)就(jiu)行(xing)，操(cao)作(zuo)也(ye)比較簡單，原理(li)如(ru)下（二抗(kang)用(yong)HRP標(biao)記(ji)）：反應底物為過氧化物+魯(lu)米(mi)諾(nuo)，如(ru)遇(yu)到HRP，即發(fa)光，可(ke)使膠(jiao)片曝光，就(jiu)可(ke)洗出條(tiao)帶(dai)。

三(san)、 主(zhu)要(yao)試(shi)劑(ji)

、 丙(bing)烯(xi)酰胺(an)和N，N’-亞(ya)甲雙丙(bing)烯(xi)酰胺(an)，應以(yi)溫熱(re)（以(yi)利於溶解(jie)雙丙(bing)稀酰胺(an)）的(de)去(qu)離(li)子水(shui)配(pei)制(zhi)含(han)有(you)29%（w/v）丙(bing)稀酰胺(an)和%（w/v）N，N’-亞(ya)甲雙丙(bing)烯(xi)酰胺(an)儲(chu)存(cun)液丙(bing)稀酰胺(an)29g，N，N-亞(ya)甲叉雙丙(bing)稀酰胺(an)g，加H2O至(zhi) 00ml。）儲(chu)於棕(zong)色瓶，4℃避(bi)光保存(cun)。嚴(yan)格(ge)核實PH不(bu)得(de)超(chao)過7.0，因(yin)可(ke)以(yi)發(fa)生脫氨基(ji)反應是(shi)光催化或堿(jian)催(cui)化的(de)。使用(yong)期不得(de)超(chao)過兩(liang)個(ge)月(yue)，隔幾(ji)個(ge)月須重新配(pei)制(zhi)。如(ru)有(you)沈(chen)澱，可(ke)以(yi)過濾(lv)。  2、 十二烷(wan)基(ji)硫#鈉SDS溶(rong)液:0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去(qu)離(li)子水(shui)配(pei)制(zhi)，室(shi)溫(wen)保存(cun)。

3、 分(fen)離膠(jiao)緩沖(chong)液:.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和48mlmol/L HCl 混(hun)合(he)，加水稀釋(shi)到00ml終(zhong)體(ti)積(ji)。過(guo)濾(lv)後(hou)40℃保存(cun)。

4、 濃(nong)縮膠(jiao)緩沖(chong)液:0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶(rong)於40mlH2O中(zhong)，用約(yue)48ml mol/L HCl調(tiao)至(zhi)pH6.8加水稀釋(shi)到00ml終(zhong)體(ti)積(ji)。過(guo)濾(lv)後(hou)40C保存(cun)。這兩(liang)種(zhong)緩(huan)沖液必(bi)須使(shi)用Tris堿(jian)制(zhi)備，再用(yong)HCL調(tiao)節(jie)PH值(zhi)，而(er)不(bu)用(yong) Tris.CL。

5、 TEMED原溶(rong)液N，N，N’N’四(si)甲基(ji)乙二胺(an)催化過硫#銨形(xing)成(cheng)自(zi)由基(ji)而(er)加速兩(liang)種(zhong)丙(bing)稀酰胺(an)的(de)聚合。PH太(tai)低(di)時(shi)，聚合反應受(shou)到抑制(zhi)。0%（w/v）過(guo)硫#胺(an)溶液。提(ti)供(gong)兩(liang)種(zhong)丙(bing)稀酰胺(an)聚合所必(bi)須的(de)自由基(ji)。去(qu)離(li)子水(shui)配(pei)制(zhi)數(shu)ml，臨用(yong)前(qian)配(pei)制(zhi).

6、 SDS- PAGE加樣緩(huan)沖(chong)液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩(huan)沖液8ml，甘油(you)6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰(qiu)基(ji)乙醇(chun)3.2ml，0.05%溴酚藍(lan).6ml，H2O 32ml混(hun)勻(yun)備用。按(an):或:2比例(li)與(yu)蛋白(bai)質樣(yang)品混(hun)合(he)，在沸(fei)水終煮(zhu)3min混(hun)勻(yun)後(hou)再(zai)上(shang)樣(yang)，壹(yi)般(ban)為20-25ul，總(zong)蛋白(bai)量00μg。

7、 Tris-甘氨#電(dian)泳緩沖液:30.3gTris，88g甘氨#，0gSDS，用(yong)蒸(zheng)餾(liu)水(shui)溶解(jie)至(zhi)000ml，得(de)0.25mol/L Tris-.92mol/L甘氨#電(dian)極緩(huan)沖(chong)液。臨用(yong)前(qian)稀釋(shi)0倍(bei)。

8、 轉移(yi)緩(huan)沖(chong)液：配(pei)制(zhi)L轉移(yi)緩(huan)沖(chong)液，需(xu)稱(cheng)取2.9g甘氨#、5.8gTris堿(jian)、0.37g SDS，並(bing)加入(ru)200ml甲醇，加水至(zhi)總量(liang)L。

9、 麗(li)春紅染液儲(chu)存(cun)液：麗(li)春(chun)紅S 2g 三(san)#乙(yi)#30g 磺(huang)基(ji)水楊(yang)# 30g 加水至(zhi)00ml 用(yong)時(shi)上述(shu)儲(chu)存(cun)液稀釋(shi)0倍(bei)即成(cheng)麗(li)春(chun)紅(hong)S使(shi)用液。使(shi)用(yong)後(hou)應(ying)予以(yi)廢(fei)棄。

0、 脫脂奶(nai)粉(fen)5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊(die)氮鈉（有(you)毒(du)，戴手套操(cao)作(zuo)），溶(rong)於磷#緩(huan)沖鹽溶液（PBS）。

2、 Tris緩(huan)沖鹽溶液（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠(shu)抗人-MMP-9（6）鼠(shu)抗人-TIMP-。

4、 過(guo)氧化物酶標(biao)記(ji)的(de)第(di)二抗(kang)體(ti)。

5、 NBT（溶(rong)於70%二甲基(ji)甲酰胺(an)，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶(rong)於00%二甲基(ji)甲酰胺(an)，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。