【概(gai)要描(miao)述(shu)】丙(bing)烯酰(xian)胺（Acrylamide） Western Blot)是將(jiang)蛋(dan)白(bai)質(zhi)轉(zhuan)移(yi)到(dao)膜上(shang)，然後利用抗體(ti)進(jin)行檢測(ce)。

丙(bing)烯酰(xian)胺（Acrylamide） 
  Western Blot技術:

壹(yi)、 原(yuan)理

與(yu)Southern或(huo)Northern雜交方法(fa)類似，但(dan)Western Blot采(cai)用(yong)的(de)是聚(ju)丙(bing)烯酰(xian)胺凝(ning)膠(jiao)電(dian)泳(yong)，被檢測(ce)物是蛋(dan)白(bai)質(zhi)，“探(tan)針”是抗體(ti)，“顯(xian)色”用(yong)標記的(de)二(er)抗。經過(guo)PAGE分(fen)離的(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)樣品(pin)，轉(zhuan)移(yi)到(dao)固相載(zai)體(ti)（例如硝(xiao)#纖(xian)維(wei)素(su)薄膜）上(shang)，固相載(zai)體(ti)以(yi)非共(gong)價鍵形式吸附(fu)蛋(dan)白(bai)質(zhi)，且能保(bao)持(chi)電(dian)泳(yong)分離的(de)多(duo)肽(tai)類型及(ji)其(qi)生物學(xue)活(huo)性(xing)不變(bian)。以(yi)固相載(zai)體(ti)上(shang)的(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)或多(duo)肽(tai)作(zuo)為(wei)抗原(yuan)，與對應(ying)的(de)抗體(ti)起(qi)免疫(yi)反應(ying)，再與(yu)酶或(huo)同(tong)位(wei)素(su)標記的(de)第(di)二(er)抗體(ti)起(qi)反應(ying)，經過(guo)底物(wu)顯色或放(fang)射(she)自顯影以(yi)檢測(ce)電泳分(fen)離的(de)特(te)異(yi)性(xing)目的(de)基因表(biao)達(da)的(de)蛋(dan)白(bai)成(cheng)分。該(gai)技術也(ye)廣泛(fan)應(ying)用於(yu)檢測(ce)蛋(dan)白(bai)水(shui)平(ping)的(de)表(biao)達(da)。

二(er)、分(fen)類（Acrylamide） 
現常用(yong)的(de)有(you)底物化(hua)學(xue)發(fa)光(guang)ECL和(he)底物(wu)DAB呈(cheng)色，體(ti)同(tong)水(shui)平(ping)和(he)實(shi)驗(yan)條(tiao)件的(de)是用(yong)*種方法(fa)，目前(qian)發(fa)表(biao)文章通常是用(yong)底(di)物化(hua)學(xue)發(fa)光(guang)ECL。只(zhi)要買(mai)現成的(de)試(shi)劑(ji)盒就行(xing)，操作(zuo)也(ye)比較(jiao)簡單(dan)，原(yuan)理如(ru)下(xia)（二(er)抗用HRP標記）：反應(ying)底物(wu)為(wei)過氧化(hua)物+魯(lu)米諾，如(ru)遇到(dao)HRP，即(ji)發(fa)光(guang)，可使(shi)膠片(pian)曝光(guang)，就(jiu)可洗出條(tiao)帶(dai)。

三、 主(zhu)要試(shi)劑(ji)

、 和(he)N，N’-亞甲雙(shuang)，應(ying)以(yi)溫熱(re)（以(yi)利於溶(rong)解雙(shuang)丙(bing)稀酰(xian)胺）的(de)去離(li)子(zi)水(shui)配(pei)制含有(you)29%（w/v）丙(bing)稀酰(xian)胺和(he)%（w/v）N，N’-亞甲雙(shuang)儲(chu)存液(ye)丙(bing)稀酰(xian)胺29g，N，N-亞甲叉雙(shuang)丙(bing)稀酰(xian)胺g，加(jia)H2O至(zhi) 00ml。）儲(chu)於棕(zong)色瓶，4℃避光(guang)保(bao)存(cun)。嚴(yan)格(ge)核實(shi)PH不得超過7.0，因可以(yi)發(fa)生脫(tuo)氨(an)基反應(ying)是光(guang)催(cui)化(hua)或堿催化(hua)的(de)。使用(yong)期(qi)不得超過兩(liang)個(ge)月(yue)，隔(ge)幾(ji)個(ge)月(yue)須重新(xin)配(pei)制。如有(you)沈澱(dian)，可以(yi)過濾(lv)。（Acrylamide） 
2、 十(shi)二(er)烷基硫(liu)#鈉(na)SDS溶(rong)液(ye):0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去離(li)子(zi)水(shui)配(pei)制，室溫保(bao)存(cun)。

3、 分(fen)離膠緩沖液:.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和(he)48mlmol/L HCl 混(hun)合，加水(shui)稀釋到00ml終體(ti)積(ji)。過濾後(hou)40℃保(bao)存(cun)。

4、 濃(nong)縮膠緩沖液:0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶(rong)於(yu)40mlH2O中(zhong)，用約48ml mol/L HCl調(tiao)至pH6.8加(jia)水(shui)稀釋到00ml終體(ti)積(ji)。過濾後(hou)40C保(bao)存(cun)。這(zhe)兩(liang)種緩沖液必須使用(yong)Tris堿(jian)制備(bei)，再(zai)用HCL調(tiao)節(jie)PH值，而不用 Tris.CL。

5、 TEMED原(yuan)溶(rong)液(ye)N，N，N’N’四(si)甲(jia)基乙二(er)胺(an)催化(hua)過硫(liu)#銨(an)形(xing)成自由基而加速兩(liang)種丙(bing)稀酰(xian)胺的(de)聚(ju)合(he)。PH太(tai)低(di)時，聚(ju)合(he)反應(ying)受到(dao)抑(yi)制。0%（w/v）過(guo)硫(liu)#胺(an)溶(rong)液(ye)。提(ti)供(gong)兩(liang)種丙(bing)稀酰(xian)胺聚(ju)合(he)所必須的(de)自由基。去離(li)子(zi)水(shui)配(pei)制數ml，臨(lin)用(yong)前(qian)配(pei)制.

6、 SDS- PAGE加(jia)樣緩沖液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖液8ml，甘(gan)油6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰(qiu)基乙醇3.2ml，0.05%溴(xiu)酚(fen)藍(lan).6ml，H2O 32ml混(hun)勻備(bei)用(yong)。按(an):或(huo):2比例與蛋(dan)白(bai)質(zhi)樣品(pin)混(hun)合(he)，在(zai)沸(fei)水(shui)終煮3min混(hun)勻後(hou)再(zai)上(shang)樣，壹(yi)般為(wei)20-25ul，總(zong)蛋(dan)白(bai)量(liang)00μg。

7、 Tris-甘(gan)氨#電(dian)泳緩沖液:30.3gTris，88g甘(gan)氨#，0gSDS，用(yong)蒸餾水(shui)溶(rong)解至000ml，得(de)0.25mol/L Tris-.92mol/L甘(gan)氨#電(dian)極緩沖液。臨(lin)用(yong)前(qian)稀釋0倍(bei)。

8、 轉(zhuan)移(yi)緩沖液：配(pei)制L轉(zhuan)移(yi)緩沖液，需稱(cheng)取(qu)2.9g甘(gan)氨#、5.8gTris堿(jian)、0.37g SDS，並(bing)加入(ru)200ml甲(jia)醇，加(jia)水(shui)至(zhi)總(zong)量(liang)L。

9、 麗(li)春紅染(ran)液儲(chu)存液(ye)：麗(li)春紅S 2g 三(san)#乙(yi)#30g 磺(huang)基水(shui)楊(yang)# 30g 加(jia)水(shui)至(zhi)00ml 用(yong)時上述(shu)儲(chu)存液(ye)稀釋0倍(bei)即(ji)成麗(li)春(chun)紅S使(shi)用液。使(shi)用後(hou)應(ying)予以(yi)廢(fei)棄。

0、 脫(tuo)脂(zhi)奶(nai)粉(fen)5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊氮(dan)鈉(na)（有(you)毒，戴(dai)手(shou)套操(cao)作(zuo)），溶(rong)於(yu)磷#緩沖鹽溶(rong)液(ye)（PBS）。

2、 Tris緩沖鹽溶(rong)液(ye)（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠(shu)抗人(ren)-MMP-9（6）鼠(shu)抗人(ren)-TIMP-。

4、 過(guo)氧化(hua)物酶標記的(de)第(di)二(er)抗體(ti)。

5、 NBT（溶(rong)於(yu)70%二(er)甲(jia)基甲酰胺，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶(rong)於(yu)00%二(er)甲(jia)基甲酰胺，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA（Acrylamide） 
做線粒體(ti)膜UCP2蛋(dan)白(bai)的(de)Western Blot （以(yi)下(xia)簡寫(xie)成Western Blot），提(ti)取(qu)線粒體(ti)後(hou)凍存（未加(jia)蛋(dan)白(bai)酶(mei)抑制劑(ji)），樣(yang)品(pin)不能反復凍(dong)融(rong);，加蛋(dan)白(bai)酶(mei)抑制劑(ji)。同(tong)時(shi)，建(jian)議檢查(zha)Western Blot過(guo)程， 提(ti)高壹(yi)抗濃(nong)度(du)。對於(yu)加蛋(dan)白(bai)酶(mei)抑制劑(ji)來(lai)說，壹(yi)般加(jia)PMSF就(jiu)可以(yi)了，能多(duo)加(jia)幾(ji)中(zhong)種蛋(dan)白(bai)酶(mei)抑制劑(ji)。
同(tong)壹(yi)蛋(dan)白(bai)樣(yang)品(pin)能(neng)同(tong)時(shi)進(jin)行兩(liang)種因子的(de)Western Blot檢測(ce)，有(you)的(de)甚至可以(yi)同(tong)時(shi)測(ce)幾(ji)十(shi)種樣品(pin)。
如(ru)果是膜蛋(dan)白(bai)和(he)胞(bao)漿(jiang)蛋(dan)白(bai)，所(suo)用的(de)去垢(gou)劑(ji)就(jiu)要溫和(he)得多(duo)，這(zhe)時(shi)加(jia)上(shang)NaF去抑(yi)制(zhi)磷#化(hua)酶的(de)活(huo)性(xing)。
樣品(pin)的(de)蛋(dan)白(bai)含量(liang)很(hen)低(di)，每微升(sheng)不到微(wei)克，但(dan)是在(zai)轉(zhuan)膜時(shi)經常會(hui)發(fa)現只有(you)壹(yi)部分蛋(dan)白(bai)轉(zhuan)到了膜上(shang)，就是在(zai)轉(zhuan)膜後(hou)染(ran)膠發(fa)現有(you)的(de)孔(kong)所有(you)的(de)蛋(dan)白(bai)條(tiao)帶都(dou)在(zai)，只(zhi)是顏(yan)色變(bian)淡(dan)了，可以(yi)加大(da)上(shang)樣(yang)量，轉(zhuan)移(yi)時(shi)可以(yi)用減(jian)少(shao)電(dian)流延長(chang)時(shi)間(jian)，多(duo)加(jia)5-0%甲(jia)醇。
想分離的(de)蛋(dan)白(bai)是分(fen)子(zi)量260kd的(de)，SDS-PAGE電泳(yong)的(de)分離(li)膠濃(nong)度(du)用6%，Stacking Gel 3.5%，但(dan)260kd的(de)蛋(dan)白(bai)不好做
如果上樣量超載(zai)，可以(yi)濃(nong)縮樣品(pin)，也(ye)可以(yi)根據妳(ni)的(de)目標分子量(liang)透(tou)析(xi)掉(diao)壹(yi)部分小分子蛋(dan)白(bai)。壹(yi)般地，超載(zai)30%是不會有(you)問題(ti)的(de)。如果已經超了不少了，而且小分(fen)子(zi)量(liang)的(de)也要，可以(yi)考慮(lv)加大膠的(de)厚(hou)度(du)，可以(yi)試(shi)試(shi).5mm的(de) comb。
蛋(dan)白(bai)變(bian)性(xing)後存(cun)放(fang)-80℃，壹(yi)兩(liang)年(nian)沒(mei)有(you)問題(ti)，zui關(guan)鍵(jian)兩(liang)條(tiao)：不要被蛋(dan)白(bai)酶(mei)水(shui)解掉(diao);不要被細(xi)菌消化(hua)掉(diao)（也是被酶(mei)水(shui)解了）。
采(cai)用(yong)DAB顯色技術，二(er)抗是化(hua)的(de)多(duo)克(ke)隆(long)抗體(ti)，三(san)抗是親(qin)和(he)素(su)體(ti)系(xi)，不能使(shi)用脫(tuo)脂(zhi)奶(nai)粉(fen)，脫(tuo)脂(zhi)奶(nai)粉(fen)會(hui)影響親(qin)和(he)素(su)的(de)生成，因為(wei)脫(tuo)脂(zhi)奶(nai)粉(fen)中(zhong)含，用(yong)BSA代(dai)替(ti)應(ying)該(gai)好壹(yi)點(dian).
Western Blot壹(yi)般上(shang)樣(yang)30-00微(wei)克(ke)不等，結(jie)果跟目(mu)的(de)蛋(dan)白(bai)的(de)豐度(du)、上樣(yang)量、壹(yi)二(er)抗的(de)量和(he)撫育(yu)時間(jian)都(dou)有(you)關系，也(ye)與顯色時間(jian)長短(duan)有(you)關。開(kai)始(shi)摸條件時，為(wei)了拿(na)到(dao)陽(yang)性(xing)結(jie)果，各個步驟(zhou)都(dou)可以(yi)量多(duo)壹(yi)點(dian)時(shi)間(jian)長壹(yi)點(dian)，當(dang)然(ran)背(bei)景(jing)也(ye)就出來了。要拿(na)到(dao)好的(de)結(jie)果，如果抗體(ti)好的(de)話比較(jiao)容(rong)易(yi)，抗體(ti)不好的(de)話就(jiu)需要反復地試(shi)了，當(dang)然(ran)有(you)的(de)不適(shi)合Western Blot的(de)怎(zen)樣(yang)做也不行。所(suo)以(yi)拿(na)到(dao)好的(de)結(jie)果不容(rong)易(yi)。