【概要(yao)描述】兔(tu)抗人間變(bian)型(xing)淋巴(ba)瘤激(ji)酶(mei)多克隆(long)抗體(ti) Anaplastic Lymphoma Kinase Western免疫(yi)印跡(Western Blot)是(shi)將(jiang)蛋白質(zhi)轉移到膜上(shang)，然後(hou)利用抗體(ti)進(jin)行(xing)檢測(ce)。

 兔抗(kang)人間變(bian)型(xing)淋巴(ba)瘤激(ji)酶(mei)多克隆(long)抗體(ti) Anaplastic Lymphoma Kinase  Western Blot技術: 做(zuo)線(xian)粒體(ti)膜(mo)UCP2蛋白的(de)Western Blot （以下簡寫(xie)成Western Blot），提(ti)取(qu)線粒體(ti)後(hou)凍存（未加蛋白酶(mei)抑制劑(ji)），樣(yang)品(pin)不(bu)能(neng)反(fan)復凍融;，加蛋白酶(mei)抑制劑(ji)。同(tong)時(shi)，建議(yi)檢查(zha)Western Blot過(guo)程， 提(ti)高(gao)壹抗濃度(du)。對於加蛋白酶(mei)抑制劑(ji)來(lai)說，壹般加PMSF就(jiu)可以了(le)，能(neng)多加幾(ji)中(zhong)種(zhong)蛋白酶(mei)抑制劑(ji)。
同(tong)壹(yi)蛋白樣(yang)品(pin)能同時(shi)進(jin)行(xing)兩種(zhong)因(yin)子的(de)Western Blot檢測(ce)，有(you)的甚至可以同(tong)時(shi)測幾(ji)十種樣 兔抗人間變(bian)型(xing)淋巴(ba)瘤激(ji)酶(mei)多克隆(long)抗體(ti) Anaplastic Lymphoma Kinase  如果是膜(mo)蛋白和(he)胞(bao)漿(jiang)蛋白，所(suo)用(yong)的去垢劑(ji)就(jiu)要溫(wen)和(he)得(de)多，這(zhe)時(shi)加上(shang)NaF去抑制磷#化(hua)酶(mei)的活性(xing)。
樣品(pin)的蛋白含(han)量(liang)很(hen)低，每微(wei)升不(bu)到微(wei)克，但(dan)是在轉膜時(shi)經常(chang)會(hui)發現(xian)只有(you)壹部分(fen)蛋白轉到了膜(mo)上，就(jiu)是在轉膜後(hou)染(ran)膠發現(xian)有(you)的孔所(suo)有(you)的蛋白條(tiao)帶(dai)都在，只是(shi)顏色變(bian)淡(dan)了，可以加大上(shang)樣(yang)量(liang)，轉移時可以用(yong)減(jian)少(shao)電流延(yan)長時(shi)間(jian)，多(duo)加5-0%甲(jia)醇(chun)。
想(xiang)分離的(de)蛋白是(shi)分(fen)子量260kd的(de)，SDS-PAGE電泳(yong)的(de)分(fen)離(li)膠濃度用(yong)6%，Stacking Gel 3.5%，但260kd的蛋白不(bu)好做(zuo)
如果上樣(yang)量(liang)超載(zai)，可以濃(nong)縮樣(yang)品(pin)，也(ye)可以根據妳的(de)目(mu)標分(fen)子(zi)量透(tou)析(xi)掉壹部(bu)分小(xiao)分(fen)子蛋白。壹(yi)般地(di)，超(chao)載(zai)30%是(shi)不(bu)會(hui)有(you)問題的(de)。如果已經超(chao)了(le)不(bu)少(shao)了，而(er)且小(xiao)分(fen)子量的也(ye)要(yao)，可以考(kao)慮(lv)加大膠(jiao)的(de)厚(hou)度，可以試(shi)試(shi).5mm的 comb。
蛋白變(bian)性(xing)後存(cun)放(fang)-80℃，壹(yi)兩年沒有(you)問題，zui關(guan)鍵(jian)兩條：不(bu)要(yao)被(bei)蛋白酶(mei)水解掉;不(bu)要(yao)被(bei)細(xi)菌消(xiao)化(hua)掉（也(ye)是(shi)被(bei)酶(mei)水解了(le)）。
采(cai)用DAB顯(xian)色(se)技術，二(er)抗(kang)是化(hua)的(de)多克隆(long)抗體(ti)，三抗是親(qin)和(he)素體(ti)系，不(bu)能(neng)使(shi)用(yong)脫脂(zhi)奶(nai)粉，脫脂(zhi)奶(nai)粉會(hui)影(ying)響親(qin)和(he)素的(de)生成，因(yin)為(wei)脫脂(zhi)奶(nai)粉中(zhong)含(han)，用(yong)BSA代替(ti)應該(gai)好壹點. Anaplastic Lymphoma Kinase  Western Blot壹般上樣(yang)30-00微(wei)克不(bu)等，結果跟(gen)目的(de)蛋白的(de)豐(feng)度、上樣(yang)量(liang)、壹二(er)抗的(de)量和(he)撫育(yu)時(shi)間(jian)都(dou)有(you)關(guan)系，也(ye)與(yu)顯(xian)色(se)時間長短(duan)有(you)關(guan)。開(kai)始(shi)摸(mo)條(tiao)件(jian)時(shi)，為(wei)了(le)拿到陽性(xing)結果，各(ge)個步(bu)驟都可以量(liang)多(duo)壹點時間長壹(yi)點，當(dang)然背(bei)景也(ye)就(jiu)出來了。要拿到好的結果，如果抗體(ti)好的話比(bi)較容易(yi)，抗(kang)體(ti)不(bu)好的話就(jiu)需要反(fan)復地(di)試(shi)了，當(dang)然有(you)的不(bu)適(shi)合Western Blot的怎(zen)樣(yang)做(zuo)也(ye)不(bu)行(xing)。所(suo)以拿(na)到好的結果不(bu)容易(yi)。

Anaplastic Lymphoma Kinase  壹(yi)、 原理(li)

與(yu)Southern或Northern雜交方法(fa)類似(si)，但Western Blot采(cai)用(yong)的(de)是聚丙(bing)烯(xi)酰胺凝膠電(dian)泳，被(bei)檢測物(wu)是蛋白質(zhi)，“探(tan)針(zhen)”是(shi)抗(kang)體(ti)，“顯(xian)色(se)”用(yong)標記的二(er)抗。經過(guo)PAGE分(fen)離(li)的(de)蛋白質(zhi)樣(yang)品(pin)，轉移到固相(xiang)載(zai)體(ti)（例如硝#纖(xian)維素薄膜）上(shang)，固(gu)相(xiang)載(zai)體(ti)以非(fei)共價(jia)鍵(jian)形式(shi)吸(xi)附(fu)蛋白質(zhi)，且能(neng)保(bao)持電泳分離的(de)多肽(tai)類型及其生(sheng)物學(xue)活(huo)性(xing)不(bu)變(bian)。以固(gu)相(xiang)載(zai)體(ti)上(shang)的(de)蛋白質(zhi)或多肽(tai)作為(wei)抗(kang)原，與對應的抗體(ti)起(qi)免疫(yi)反(fan)應(ying)，再與酶(mei)或同位(wei)素標記的第(di)二抗(kang)體(ti)起(qi)反(fan)應(ying)，經過(guo)底(di)物顯(xian)色(se)或放(fang)射(she)自顯(xian)影(ying)以檢(jian)測(ce)電泳(yong)分離的特(te)異(yi)性(xing)目的(de)基因(yin)表(biao)達(da)的蛋白成(cheng)分(fen)。該(gai)技術也(ye)廣(guang)泛應用(yong)於檢測(ce)蛋白水平的表(biao)達(da)。

二、分類  現常(chang)用的(de)有(you)底物化(hua)學(xue)發(fa)光ECL和(he)底(di)物DAB呈(cheng)色(se)，體(ti)同(tong)水平和(he)實驗條(tiao)件(jian)的(de)是用(yong)*種方法(fa)，目(mu)前發(fa)表(biao)文章(zhang)通常(chang)是用(yong)底(di)物(wu)化(hua)學(xue)發(fa)光ECL。只要(yao)買(mai)現成(cheng)的試劑(ji)盒(he)就(jiu)行(xing)，操(cao)作也(ye)比(bi)較簡單(dan)，原(yuan)理(li)如下（二(er)抗(kang)用(yong)HRP標記）：反(fan)應(ying)底物為(wei)過(guo)氧(yang)化(hua)物(wu)+魯(lu)米諾，如遇(yu)到HRP，即(ji)發(fa)光，可使(shi)膠(jiao)片曝光，就(jiu)可洗出條帶(dai)。

三、 主(zhu)要試劑(ji)

、 丙(bing)烯(xi)酰胺和(he)N，N’-亞(ya)甲(jia)雙丙(bing)烯(xi)酰胺，應以溫(wen)熱（以利於溶解雙(shuang)丙(bing)稀酰(xian)胺）的(de)去離(li)子水配(pei)制(zhi)含(han)有(you)29%（w/v）丙(bing)稀酰(xian)胺和(he)%（w/v）N，N’-亞(ya)甲(jia)雙丙(bing)烯(xi)酰胺儲存(cun)液(ye)丙(bing)稀酰(xian)胺29g，N，N-亞(ya)甲(jia)叉雙(shuang)丙(bing)稀酰(xian)胺g，加H2O至(zhi) 00ml。）儲於棕色瓶(ping)，4℃避光保(bao)存。嚴(yan)格(ge)核實PH不(bu)得(de)超過(guo)7.0，因(yin)可以發(fa)生(sheng)脫氨(an)基(ji)反(fan)應(ying)是光催化(hua)或堿催(cui)化(hua)的(de)。使(shi)用(yong)期不(bu)得(de)超過(guo)兩(liang)個(ge)月，隔(ge)幾(ji)個月須重新(xin)配(pei)制(zhi)。如有(you)沈澱，可以過(guo)濾(lv)。  2、 十二烷基(ji)硫(liu)#鈉(na)SDS溶液:0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去離(li)子水配(pei)制(zhi)，室溫(wen)保存。

3、 分(fen)離(li)膠(jiao)緩沖(chong)液:.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和(he)48mlmol/L HCl 混(hun)合，加水稀(xi)釋到00ml終體(ti)積(ji)。過(guo)濾(lv)後40℃保(bao)存(cun)。

4、 濃(nong)縮膠(jiao)緩(huan)沖(chong)液:0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶於40mlH2O中(zhong)，用(yong)約(yue)48ml mol/L HCl調(tiao)至pH6.8加水稀(xi)釋到00ml終體(ti)積(ji)。過(guo)濾(lv)後40C保(bao)存(cun)。這(zhe)兩(liang)種(zhong)緩(huan)沖(chong)液必(bi)須使(shi)用(yong)Tris堿制(zhi)備(bei)，再用HCL調(tiao)節(jie)PH值，而不(bu)用(yong) Tris.CL。

5、 TEMED原(yuan)溶液N，N，N’N’四(si)甲(jia)基(ji)乙二胺催化(hua)過(guo)硫(liu)#銨(an)形(xing)成(cheng)自由基而加速(su)兩(liang)種(zhong)丙(bing)稀酰(xian)胺的聚合。PH太(tai)低時，聚合反(fan)應(ying)受(shou)到抑制。0%（w/v）過(guo)硫(liu)#胺溶液。提(ti)供(gong)兩(liang)種丙(bing)稀酰(xian)胺聚合所(suo)必(bi)須的(de)自由(you)基(ji)。去離(li)子水配(pei)制(zhi)數(shu)ml，臨(lin)用(yong)前配(pei)制(zhi).

6、 SDS- PAGE加樣(yang)緩(huan)沖(chong)液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩(huan)沖(chong)液8ml，甘油6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰(qiu)基(ji)乙醇3.2ml，0.05%溴(xiu)酚藍(lan).6ml，H2O 32ml混(hun)勻備(bei)用。按(an):或:2比(bi)例與(yu)蛋白質(zhi)樣(yang)品(pin)混(hun)合，在沸(fei)水終煮3min混(hun)勻後再(zai)上樣(yang)，壹(yi)般為(wei)20-25ul，總蛋白量(liang)00μg。

7、 Tris-甘氨(an)#電(dian)泳(yong)緩(huan)沖(chong)液:30.3gTris，88g甘氨(an)#，0gSDS，用(yong)蒸(zheng)餾(liu)水溶解至(zhi)000ml，得(de)0.25mol/L Tris-.92mol/L甘氨(an)#電(dian)極(ji)緩(huan)沖(chong)液。臨(lin)用(yong)前稀(xi)釋0倍(bei)。

8、 轉移緩沖(chong)液：配(pei)制(zhi)L轉移緩沖(chong)液，需稱取(qu)2.9g甘氨(an)#、5.8gTris堿、0.37g SDS，並(bing)加入(ru)200ml甲(jia)醇(chun)，加水至(zhi)總量L。

9、 麗春(chun)紅(hong)染(ran)液(ye)儲存(cun)液(ye)：麗春(chun)紅(hong)S 2g 三#乙#30g 磺(huang)基(ji)水楊(yang)# 30g 加水至(zhi)00ml 用(yong)時(shi)上(shang)述儲存(cun)液(ye)稀釋(shi)0倍(bei)即(ji)成(cheng)麗春(chun)紅(hong)S使(shi)用(yong)液。使(shi)用(yong)後應(ying)予(yu)以廢(fei)棄(qi)。

0、 脫脂(zhi)奶(nai)粉5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊(die)氮(dan)鈉(na)（有(you)毒，戴(dai)手(shou)套操(cao)作），溶於磷#緩(huan)沖(chong)鹽溶液（PBS）。

2、 Tris緩(huan)沖(chong)鹽溶液（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠(shu)抗(kang)人-MMP-9（6）鼠(shu)抗(kang)人-TIMP-。

4、 過(guo)氧(yang)化(hua)物(wu)酶(mei)標記的第(di)二抗(kang)體(ti)。

5、 NBT（溶於70%二(er)甲(jia)基(ji)甲酰胺，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶於00%二(er)甲(jia)基(ji)甲酰胺，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。