【概(gai)要(yao)描述】兔(tu)胰腺(xian)星(xing)狀(zhuang)細(xi)胞(bao)的(de)相(xiang)關產(chan)品：LX-2+GFP人(ren)肝(gan)星(xing)形(xing)細(xi)胞(bao)豬(zhu)原代甲(jia)狀(zhuang)腺(xian)上(shang)皮細(xi)胞(bao)人(ren)原代膽脂瘤細(xi)胞(bao)大(da)鼠(shu)原代α-SMA陽(yang)性(xing) 腎(shen)周肌(ji)成(cheng)纖維細(xi)胞(bao)人(ren)原代脂肪間充質(zhi)幹細(xi)胞(bao)大(da)鼠(shu)原代肺(fei)動(dong)脈(mai)內皮細(xi)胞(bao)人(ren)原代子宮瘤細(xi)胞(bao)大(da)鼠(shu)原代腎(shen)上(shang)皮細(xi)胞(bao)人(ren)原代睪(gao)丸(wan)支(zhi)持細(xi)胞(bao)兔(tu)原代腹(fu)腔(qiang)巨(ju)噬細(xi)胞(bao)

兔(tu)胰腺(xian)星(xing)狀(zhuang)細(xi)胞(bao)

培養基(ji) 含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等(deng)

換液(ye)頻率(lv) 每2-3天換(huan)液(ye)壹(yi)次

生長特性(xing) 貼壁(bi)

細(xi)胞(bao)形(xing)態 成纖(xian)維細(xi)胞(bao)樣

傳代(dai)特(te)性(xing) 可傳(chuan)3-5代

消化(hua)液(ye) 0.25%yi蛋白(bai)酶

培養條(tiao)件(jian) 氣相(xiang)：空(kong)氣(qi)，95%；CO2，5%

兔(tu)胰腺(xian)星(xing)狀(zhuang)分(fen)離(li)自胰(yi)腺(xian)組(zu)織(zhi)；胰(yi)腺(xian)分(fen)為(wei)外(wai)分(fen)泌腺(xian)和(he)內(nei)分(fen)泌腺(xian)兩(liang)部(bu)分(fen)。外(wai)分(fen)泌腺(xian)由(you)腺(xian)泡和腺(xian)管(guan)組(zu)成(cheng)，腺(xian)泡分(fen)泌胰液(ye)，腺(xian)管(guan)是胰(yi)液(ye)排(pai)出(chu)的通(tong)道。胰液(ye)中(zhong)含有(you)碳(tan)suan氫鈉(na)、yi蛋(dan)白(bai)酶原、脂肪酶、澱粉mei等(deng)。胰液(ye)通(tong)過胰腺(xian)管(guan)排(pai)入十(shi)二(er)指腸(chang)，有(you)消化(hua)蛋(dan)白質(zhi)、脂肪和(he)糖(tang)的作(zuo)用。內分(fen)泌腺(xian)由(you)大(da)小不同的(de)細(xi)胞(bao)團(tuan)──胰(yi)島所(suo)組(zu)成(cheng)，胰(yi)島主(zhu)要(yao)由4種(zhong)細(xi)胞(bao)組(zu)成(cheng)：α細(xi)胞(bao)、β細(xi)胞(bao)、γ細(xi)胞(bao)及(ji)PP細(xi)胞(bao)。α細(xi)胞(bao)分(fen)泌胰高(gao)血(xue)糖(tang)素，升(sheng)高血(xue)糖(tang)；β細(xi)胞(bao)分(fen)泌胰島素(su)，降低(di)血(xue)糖(tang)；γ細(xi)胞(bao)分(fen)泌生長抑su，以旁分(fen)泌的方(fang)式抑制(zhi)α、β細(xi)胞(bao)的(de)分(fen)泌；PP細(xi)胞(bao)分(fen)泌胰多(duo)肽，抑制(zhi)胃腸運(yun)動(dong)、胰液(ye)分(fen)泌和膽囊收(shou)縮(suo)。纖維化是慢(man)性(xing)胰(yi)腺(xian)炎的(de)典型病(bing)理(li)特(te)征(zheng)，活(huo)化(hua)的(de)胰腺(xian)星(xing)狀(zhuang)細(xi)胞(bao)（PSC）是胰(yi)腺(xian)纖(xian)維化的(de)主要(yao)效(xiao)應(ying)細(xi)胞(bao)，PSC分(fen)離(li)和(he)成(cheng)功(gong)培養是體(ti)外(wai)研(yan)究胰腺(xian)纖(xian)維化的(de)重要(yao)前提(ti)。未(wei)活(huo)性(xing)化(hua)的PSC胞(bao)漿中富(fu)含維A脂滴(di)，並(bing)表(biao)達Desmin蛋白，活(huo)化(hua)後(hou)的PSC則(ze)表(biao)達α-平滑肌(ji)肌(ji)動(dong)蛋白(bai)（alpha-SMA）。PSC具有(you)靜息(xi)態與激活(huo)態兩種(zhong)，並(bing)分(fen)別具有(you)特異(yi)的(de)標(biao)誌(zhi)物(wu)。靜息(xi)狀(zhuang)態PSC胞(bao)質(zhi)內(nei)富含的脂滴(di)可(ke)以被油(you)紅(hong)O染(ran)成(cheng)紅色，陽性(xing)表(biao)達Desmin。激活(huo)狀(zhuang)態PSC陽性(xing)表(biao)達alpha-SMA。油(you)紅(hong)O染(ran)色(se)發現(xian)，原代分(fen)離(li)的(de)細(xi)胞(bao)培養6d，胞(bao)漿中仍可(ke)見(jian)明(ming)顯的(de)脂滴(di)，傳(chuan)代後(hou)，橙紅色(se)的脂滴(di)顆(ke)粒(li)顯(xian)著(zhu)減(jian)少甚至(zhi)消(xiao)失(shi)。免(mian)疫細(xi)胞(bao)化(hua)學染色(se)顯(xian)示(shi)，細(xi)胞(bao)接(jie)種(zhong)24h仍然表(biao)達Desmin，48h後(hou)Desmin基(ji)本(ben)不再(zai)表(biao)達。培養48h後(hou)絕(jue)大(da)多數(shu)細(xi)胞(bao)開(kai)始(shi)表(biao)達alpha-SMA，隨著培養時(shi)間的增長和傳代(dai)次數(shu)的(de)增加，細(xi)胞(bao)表(biao)達alpha-SMA，而不再(zai)表(biao)達Desmin，說明(ming)細(xi)胞(bao)活(huo)化(hua)。提(ti)示(shi)PSC接(jie)種24h後(hou)即(ji)啟(qi)動(dong)了激活(huo)過程(cheng)，至培養第6d大(da)多數(shu)細(xi)胞(bao)激活(huo)，傳(chuan)代(dai)後(hou)細(xi)胞(bao)處(chu)於高度激活(huo)狀(zhuang)態。原代胰(yi)腺(xian)星(xing)狀(zhuang)細(xi)胞(bao)可(ke)作(zuo)為(wei)慢(man)性(xing)胰(yi)腺(xian)炎新(xin)藥(yao)的細(xi)胞(bao)篩(shai)選(xuan)模型(xing)，目前研(yan)究發現(xian)：胰腺(xian)受(shou)損(sun)時(shi)，在各(ge)種(zhong)刺(ci)激因子作用下使胰(yi)腺(xian)星(xing)狀(zhuang)細(xi)胞(bao)活(huo)化(hua)，導(dao)致細(xi)胞(bao)形(xing)態、功(gong)能(neng)發生變化，促(cu)使基(ji)質(zhi)增生、膠原蛋白(bai)的大(da)量生成及(ji)不規(gui)則(ze)沈積(ji)。
方法(fa)簡(jian)介：

公司(si)實驗(yan)室分(fen)離(li)的(de)兔(tu)胰腺(xian)星(xing)狀(zhuang)采(cai)用(yong)膠(jiao)原酶消化(hua)法制(zhi)備(bei)而來制備(bei)而來，細(xi)胞(bao)總量約(yue)為(wei)5×10?cells/瓶(ping)。
質(zhi)量(liang)檢測(ce)：

公司(si)實驗(yan)室分(fen)離(li)的(de)兔(tu)胰腺(xian)星(xing)狀(zhuang)經(jing)α-SMA、Desmin免疫(yi)熒(ying)光(guang)鑒(jian)定，純(chun)度(du)可(ke)達90%以上(shang)，且不含(han)有(you)HIV-1、HBV、HCV、支(zhi)原體(ti)、細(xi)菌、酵母和真(zhen)菌等(deng)。

壹、細(xi)胞(bao)培養

1取(qu)材(cai) 在(zai)無(wu)菌環境(jing)下從(cong)機體(ti)取(qu)出(chu)某(mou)種組(zu)織(zhi)細(xi)胞(bao)（視(shi)實(shi)驗(yan)目的而(er)定），經(jing)過壹定(ding)的處(chu)理(li)（如(ru)消(xiao)化分(fen)散(san)細(xi)胞(bao)、分(fen)離(li)等(deng)）後(hou)接入培養器血(xue)中(zhong)，這(zhe)壹過程(cheng)稱(cheng)為(wei)取(qu)材(cai)。如(ru)是細(xi)胞(bao)株(zhu)的擴大(da)培養則(ze)無(wu)取(qu)材(cai)這(zhe)壹過程(cheng)。機體(ti)取(qu)出(chu)的組(zu)織(zhi)細(xi)胞(bao)的(de)培養稱(cheng)為(wei)原代培養。2培養 將取(qu)得(de)的(de)組織(zhi)細(xi)胞(bao)接(jie)入培養瓶(ping)或(huo)培養板(ban)中(zhong)的(de)過程(cheng)稱(cheng)為(wei)培養。3凍(dong)存(cun)及(ji)復蘇（可(ke)參(can)閱(yue)後(hou)面有(you)關章(zhang)節）為(wei)了保存(cun)細(xi)胞(bao)，特(te)別是不易(yi)獲得(de)的(de)突變型細(xi)胞(bao)或(huo)細(xi)胞(bao)株(zhu)，要(yao)將細(xi)胞(bao)凍(dong)存(cun)。凍(dong)存(cun)的溫度壹般用液(ye)氮(dan)的溫度－196℃，將細(xi)胞(bao)收(shou)集至凍(dong)存(cun)管中加入含(han)保(bao)護(hu)劑（壹般為(wei)二(er)甲(jia)亞碸或(huo)甘油(you)）的(de)培養基(ji)，以壹定(ding)的(de)冷(leng)卻速(su)度(du)凍(dong)存(cun)，最(zui)終(zhong)保存於液(ye)氮(dan)中。在(zai)極(ji)低(di)的(de)溫度下，細(xi)胞(bao)保(bao)存(cun)的(de)時(shi)間幾(ji)乎是無(wu)限(xian)的(de)。復蘇壹(yi)般采(cai)用(yong)快融方法，即(ji)從(cong)液(ye)氮(dan)中取(qu)出(chu)凍(dong)存(cun)管後(hou)，立即(ji)放入37℃水(shui)中(zhong)，使之(zhi)在(zai)壹分(fen)鐘(zhong)內迅速(su)融(rong)解(jie)。然後(hou)將細(xi)胞(bao)轉入培養器皿(min)中(zhong)進行(xing)培養。

二(er)、原代細(xi)胞(bao)分(fen)離(li)

凡是來源(yuan)於胚胎(tai)、組(zu)織(zhi)器官(guan)及(ji)外(wai)周(zhou)血(xue)，經(jing)特(te)殊(shu)分(fen)離(li)方(fang)法(fa)制(zhi)備(bei)而來的原初培養的細(xi)胞(bao)稱(cheng)之為(wei)原代細(xi)胞(bao)。1懸浮細(xi)胞(bao)的(de)分(fen)離(li)方(fang)法(fa)組(zu)織(zhi)材(cai)料(liao)若來自血(xue)液(ye)、羊(yang)水(shui)、胸(xiong)水(shui)或(huo)腹水(shui)的(de)懸液(ye)材(cai)料(liao)，的方(fang)法是采(cai)用(yong)1000r/min的(de)低(di)速(su)離(li)心(xin)10分(fen)鐘(zhong)。經(jing)離(li)心(xin)後(hou)由於各(ge)種(zhong)細(xi)胞(bao)的(de)比(bi)重不同可(ke)在分(fen)層液(ye)中(zhong)形成(cheng)不同層，這(zhe)樣可根(gen)據需要(yao)收獲目的細(xi)胞(bao)。2實(shi)體(ti)組織(zhi)材(cai)料(liao)的分(fen)離(li)方(fang)法(fa)對於實體(ti)組織(zhi)材(cai)料(liao)，由於細(xi)胞(bao)間結合緊密(mi)，為(wei)了使組(zu)織(zhi)中(zhong)的(de)細(xi)胞(bao)充(chong)分(fen)分(fen)散(san)，形成(cheng)細(xi)胞(bao)懸液(ye)，可(ke)采(cai)用(yong)機(ji)械分(fen)散(san)法（物(wu)理(li)裂解）和消化(hua)分(fen)離(li)法(fa)。

三、細(xi)胞(bao)增殖(zhi)檢測(ce)技術

目前主(zhu)要(yao)有(you)兩種(zhong)用(yong)於檢測(ce)細(xi)胞(bao)增殖(zhi)能(neng)力(li)的(de)方法(fa)。壹(yi)種(zhong)是直接(jie)的(de)方法，通(tong)過直接(jie)測(ce)定進行(xing)分(fen)裂

的細(xi)胞(bao)數(shu)來評價細(xi)胞(bao)的(de)增殖(zhi)能(neng)力(li)。另(ling)壹種(zhong)是間接的方法(fa)，即(ji)細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)（cell viability）檢測(ce)方(fang)法(fa)，通(tong)過檢測(ce)樣品中(zhong)健康細(xi)胞(bao)的(de)數(shu)目來評價細(xi)胞(bao)的(de)增殖(zhi)能(neng)力(li)。顯(xian)然，細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)檢測(ce)法(fa)並(bing)不能(neng)最(zui)終(zhong)證(zheng)明(ming)檢測(ce)樣品中(zhong)的(de)細(xi)胞(bao)是否(fou)在增殖(zhi)。如細(xi)胞(bao)在(zai)某(mou)壹培養條(tiao)件(jian)下會自發啟(qi)動(dong)雕亡程(cheng)序(xu)，但藥(yao)物(wu)的幹擾可抑制(zhi)雕(diao)亡的發生；這(zhe)時(shi)若采(cai)用(yong)細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)檢測(ce)法(fa)，顯(xian)然可以區分(fen)兩(liang)種條(tiao)件(jian)下的細(xi)胞(bao)數(shu)量(liang)，但我們(men)並(bing)不能(neng)從(cong)藥(yao)物(wu)幹擾組細(xi)胞(bao)數(shu)大(da)於對照(zhao)組的事(shi)實(shi)說(shuo)明(ming)藥(yao)物(wu)可促進細(xi)胞(bao)增殖(zhi)的結(jie)論。所(suo)以最(zui)直接(jie)的(de)證(zheng)據應(ying)該采(cai)用(yong)方(fang)法壹(yi)。

取(qu)材(cai)：首先(xian)，用(yong)培養液(ye)濕(shi)潤(run)所(suo)取(qu)的(de)組(zu)織(zhi)材(cai)料(liao)，並(bing)用(yong)鋒(feng)利(li)的眼科剪(jian)去除(chu)附在(zai)其(qi)上(shang)的脂肪和(he)結(jie)締組(zu)織(zhi)。接(jie)著用平(ping)衡液(ye)（如(ru)PBS或(huo)Hanks液(ye)）漂(piao)洗(xi)，再(zai)用(yong)眼科彎剪將組織(zhi)塊剪(jian)成(cheng)小塊。多(duo)次(ci)用PBS或(huo)Hanks液(ye)漂(piao)洗(xi)，直到(dao)液(ye)體(ti)清亮(liang)、無(wu)油(you)滴(di)為(wei)止。

接種(zhong)：用(yong)濕(shi)潤(run)的(de)吸(xi)管(guan)吸(xi)取(qu)切(qie)碎(sui)的組織(zhi)塊，輕(qing)輕(qing)吹到(dao)培養瓶(ping)皿(min)中(zhong)，並(bing)按(an)壹定間距均勻放在(zai)培養瓶(ping)底(di)壁(bi)上(shang)。註(zhu)意不要(yao)過多，確(que)保組(zu)織(zhi)塊切(qie)面(mian)貼在培養瓶(ping)底(di)壁(bi)上(shang)。

培養：將培養瓶(ping)翻(fan)轉，使瓶(ping)底(di)朝(chao)上(shang)，在種植了組織(zhi)塊壹(yi)側(ce)的對側面(mian)加足(zu)培養液(ye)，避免組(zu)織(zhi)塊與(yu)培養液(ye)接(jie)觸(chu)，然後(hou)塞(sai)緊瓶(ping)塞(sai)。將種植了組(zu)織(zhi)塊的(de)壹(yi)側朝(chao)上(shang)，靜置(zhi)於37℃培養箱中(zhong)。待(dai)組織(zhi)塊貼(tie)壁(bi)1到3小時(shi)後(hou)翻瓶(ping)，使貼(tie)壁(bi)的組(zu)織(zhi)塊浸沒(mei)在(zai)培養液(ye)中(zhong)，繼續(xu)靜置(zhi)。換(huan)液(ye)：每(mei)隔2到(dao)3天(tian)更換壹(yi)次(ci)培養液(ye)，或(huo)者(zhe)根據培養瓶(ping)種(zhong)顏(yan)色(se)的(de)變化確(que)定換(huan)液(ye)時(shi)間。

壹、原代細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)

將血(xue)球計(ji)數(shu)板(ban)及(ji)蓋片用(yong)擦試幹凈，並(bing)將蓋片蓋(gai)在(zai)計(ji)數(shu)板(ban)上(shang)。

將細(xi)胞(bao)懸液(ye)吸(xi)出(chu)少許(xu)，滴加(jia)在(zai)蓋(gai)片邊(bian)緣，使懸液(ye)充(chong)滿蓋(gai)片和(he)計(ji)數(shu)板(ban)之(zhi)間。

靜置(zhi)3分(fen)鐘(zhong)。

鏡(jing)下觀(guan)察(cha)，計(ji)算計(ji)數(shu)板(ban)四(si)大(da)格細(xi)胞(bao)總數(shu)，壓(ya)線細(xi)胞(bao)只(zhi)計(ji)左側(ce)和(he)上(shang)方的。然後(hou)按(an)下式計(ji)算：

細(xi)胞(bao)數(shu)/ml＝4大(da)格細(xi)胞(bao)總數(shu)/ 4×10000

註(zhu)意：鏡(jing)下偶(ou)見(jian)由(you)兩個以上(shang)細(xi)胞(bao)組(zu)成(cheng)的(de)細(xi)胞(bao)團(tuan)，應(ying)按(an)單(dan)個(ge)細(xi)胞(bao)計(ji)算，若細(xi)胞(bao)團(tuan)占(zhan)10%以上(shang)，說明(ming)分(fen)散(san)不好，需重新(xin)制(zhi)備(bei)細(xi)胞(bao)懸液(ye)。

二(er)、原代細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)

將細(xi)胞(bao)懸液(ye)以0.5ml加入試管中。

加入0.5ml 0.4%臺盼蘭(lan)染(ran)液(ye)，染(ran)色2壹(yi)3分(fen)鐘(zhong)。

吸(xi)取(qu)少(shao)許(xu)懸液(ye)塗(tu)於載(zai)玻(bo)片上(shang)，加上(shang)蓋片。

鏡(jing)下取(qu)幾(ji)個任意視(shi)野分(fen)別計(ji)死細(xi)胞(bao)和(he)活(huo)細(xi)胞(bao)數(shu)，計(ji)細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)。

死細(xi)胞(bao)能(neng)被臺盼蘭(lan)染(ran)上(shang)色，鏡(jing)下可見(jian)深蘭(lan)色(se)的細(xi)胞(bao)，活(huo)細(xi)胞(bao)不被染色(se)，鏡(jing)下呈無(wu)色(se)透(tou)明(ming)狀(zhuang)。

活(huo)力(li)測(ce)定可以和細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)合起(qi)來進行(xing)，但要(yao)考(kao)慮(lv)到染液(ye)對原細(xi)胞(bao)懸液(ye)的(de)加倍(bei)稀釋作(zuo)用(yong)。