【概(gai)要描述】鼠抗人Synuclein單(dan)克(ke)隆抗體 a-Synuclein Western Blot)是將蛋(dan)白(bai)質(zhi)轉(zhuan)移到(dao)膜上(shang)，然(ran)後(hou)利(li)用(yong)抗(kang)體進(jin)行(xing)檢(jian)測(ce)。

鼠抗(kang)人Synuclein單(dan)克(ke)隆抗體 a-Synuclein   Western Blot技術(shu):

壹(yi)、 原理

與(yu)Southern或Northern雜交(jiao)方(fang)法(fa)類似，但Western Blot采用(yong)的(de)是聚(ju)丙烯酰胺凝膠電泳(yong)，被(bei)檢測(ce)物是蛋(dan)白(bai)質(zhi)，“探針(zhen)”是抗(kang)體，“顯(xian)色(se)”用(yong)標(biao)記的(de)二(er)抗。經(jing)過(guo)PAGE分離(li)的(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)樣(yang)品，轉(zhuan)移到(dao)固相(xiang)載(zai)體（例如(ru)硝(xiao)#纖維(wei)素(su)薄膜）上(shang)，固相(xiang)載(zai)體以非(fei)共價(jia)鍵形(xing)式吸(xi)附蛋(dan)白(bai)質(zhi)，且(qie)能(neng)保(bao)持電泳(yong)分離(li)的(de)多肽(tai)類(lei)型(xing)及其(qi)生物學(xue)活(huo)性(xing)不變(bian)。以(yi)固(gu)相(xiang)載(zai)體上(shang)的(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)或(huo)多(duo)肽作為抗(kang)原，與對應(ying)的(de)抗體起(qi)免疫(yi)反(fan)應(ying)，再(zai)與(yu)酶或(huo)同位(wei)素(su)標記的(de)第二(er)抗體起(qi)反(fan)應(ying)，經過(guo)底物顯(xian)色(se)或(huo)放(fang)射(she)自顯(xian)影以檢測電(dian)泳(yong)分離(li)的(de)特異(yi)性(xing)目(mu)的(de)基因表(biao)達的(de)蛋(dan)白(bai)成(cheng)分。該(gai)技術(shu)也(ye)廣(guang)泛應(ying)用(yong)於檢測蛋(dan)白(bai)水(shui)平(ping)的(de)表(biao)達。

二(er)、分類(lei)鼠抗(kang)人Synuclein單(dan)克(ke)隆抗體 a-Synuclein   現(xian)常(chang)用(yong)的(de)有底(di)物化(hua)學(xue)發光ECL和底(di)物DAB呈色，體同水平(ping)和實驗(yan)條件(jian)的(de)是用(yong)*種(zhong)方(fang)法(fa)，目(mu)前(qian)發表(biao)文章(zhang)通(tong)常(chang)是用(yong)底(di)物化(hua)學(xue)發光ECL。只要買現(xian)成(cheng)的(de)試(shi)劑(ji)盒就行(xing)，操(cao)作(zuo)也(ye)比較(jiao)簡單(dan)，原(yuan)理如(ru)下(xia)（二(er)抗用(yong)HRP標記）：反(fan)應(ying)底物為過(guo)氧化(hua)物+魯米(mi)諾(nuo)，如遇(yu)到(dao)HRP，即發光，可(ke)使(shi)膠片(pian)曝(pu)光(guang)，就(jiu)可洗(xi)出(chu)條帶。

三、 主要試(shi)劑(ji)

、 丙烯酰胺和N，N’-亞(ya)甲雙(shuang)丙烯酰胺，應以溫熱(re)（以利(li)於溶解雙(shuang)丙稀酰胺）的(de)去離(li)子(zi)水(shui)配制含(han)有29%（w/v）丙稀酰胺和%（w/v）N，N’-亞(ya)甲雙(shuang)丙烯酰胺儲(chu)存(cun)液丙稀酰胺29g，N，N-亞(ya)甲叉雙(shuang)丙稀酰胺g，加(jia)H2O至 00ml。）儲(chu)於棕色瓶(ping)，4℃避光保(bao)存(cun)。嚴格(ge)核(he)實PH不得(de)超過(guo)7.0，因可以(yi)發生脫(tuo)氨基反(fan)應(ying)是光(guang)催(cui)化(hua)或堿催化(hua)的(de)。使用(yong)期不得(de)超過(guo)兩個月(yue)，隔幾個(ge)月須重(zhong)新(xin)配(pei)制。如(ru)有沈澱(dian)，可以過(guo)濾。 a-Synuclein   2、 十二(er)烷基硫(liu)#鈉(na)SDS溶液:0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去離(li)子水(shui)配(pei)制，室(shi)溫保存(cun)。

3、 分離(li)膠緩(huan)沖(chong)液:.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和48mlmol/L HCl 混合(he)，加(jia)水(shui)稀釋到(dao)00ml終(zhong)體積(ji)。過(guo)濾後(hou)40℃保存(cun)。

4、 濃縮(suo)膠(jiao)緩沖(chong)液:0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶於40mlH2O中，用(yong)約(yue)48ml mol/L HCl調至(zhi)pH6.8加(jia)水(shui)稀釋到(dao)00ml終(zhong)體積(ji)。過(guo)濾後(hou)40C保存(cun)。這(zhe)兩種緩(huan)沖(chong)液必(bi)須使用(yong)Tris堿制備(bei)，再(zai)用(yong)HCL調節(jie)PH值，而(er)不用(yong) Tris.CL。

5、 TEMED原溶(rong)液N，N，N’N’四甲(jia)基乙(yi)二(er)胺催化(hua)過(guo)硫(liu)#銨(an)形(xing)成(cheng)自由(you)基而(er)加(jia)速兩種丙(bing)稀酰胺的(de)聚(ju)合。PH太低時，聚(ju)合反(fan)應(ying)受到(dao)抑制。0%（w/v）過(guo)硫(liu)#胺溶液。提(ti)供兩種丙(bing)稀酰胺聚(ju)合所必(bi)須的(de)自由(you)基。去(qu)離(li)子水(shui)配制數(shu)ml，臨用(yong)前(qian)配制.

6、 SDS- PAGE加(jia)樣(yang)緩(huan)沖(chong)液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖(chong)液8ml，甘油6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰基乙(yi)醇3.2ml，0.05%溴酚(fen)藍(lan).6ml，H2O 32ml混勻(yun)備用(yong)。按:或:2比例與(yu)蛋(dan)白(bai)質(zhi)樣(yang)品混合(he)，在沸(fei)水終(zhong)煮(zhu)3min混勻(yun)後(hou)再(zai)上(shang)樣，壹(yi)般(ban)為20-25ul，總(zong)蛋(dan)白(bai)量00μg。

7、 Tris-甘氨#電泳(yong)緩沖(chong)液:30.3gTris，88g甘氨#，0gSDS，用(yong)蒸(zheng)餾(liu)水溶解(jie)至(zhi)000ml，得(de)0.25mol/L Tris-.92mol/L甘氨#電極緩沖(chong)液。臨用(yong)前(qian)稀釋0倍(bei)。

8、 轉(zhuan)移緩沖(chong)液：配制L轉(zhuan)移緩沖(chong)液，需稱(cheng)取2.9g甘氨#、5.8gTris堿、0.37g SDS，並(bing)加(jia)入(ru)200ml甲醇(chun)，加(jia)水(shui)至(zhi)總(zong)量L。

9、 麗春紅(hong)染液儲(chu)存(cun)液：麗春紅(hong)S 2g 三#乙(yi)#30g 磺基水(shui)楊(yang)# 30g 加(jia)水(shui)至(zhi)00ml 用(yong)時上(shang)述儲(chu)存(cun)液稀釋0倍(bei)即(ji)成(cheng)麗春紅(hong)S使用(yong)液。使用(yong)後(hou)應予(yu)以廢(fei)棄(qi)。

0、 脫脂(zhi)奶粉5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊氮鈉(na)（有毒(du)，戴(dai)手(shou)套(tao)操作），溶於磷#緩沖(chong)鹽溶液（PBS）。

2、 Tris緩沖(chong)鹽溶液（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠抗(kang)人-MMP-9（6）鼠抗(kang)人-TIMP-。

4、 過(guo)氧化(hua)物酶標(biao)記的(de)第二(er)抗體。

5、 NBT（溶於70%二(er)甲基甲(jia)酰(xian)胺，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶於00%二(er)甲基甲(jia)酰(xian)胺，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA a-Synuclein   做線(xian)粒(li)體膜UCP2蛋(dan)白(bai)的(de)Western Blot （以下(xia)簡寫成(cheng)Western Blot），提(ti)取線(xian)粒(li)體後(hou)凍(dong)存(cun)（未(wei)加(jia)蛋(dan)白(bai)酶抑(yi)制劑(ji)），樣(yang)品不能(neng)反(fan)復(fu)凍(dong)融(rong);，加(jia)蛋(dan)白(bai)酶抑(yi)制劑(ji)。同時，建議檢(jian)查(zha)Western Blot過(guo)程， 提(ti)高壹(yi)抗濃度。對於加(jia)蛋(dan)白(bai)酶抑(yi)制劑(ji)來說，壹(yi)般(ban)加(jia)PMSF就(jiu)可(ke)以了，能(neng)多(duo)加(jia)幾(ji)中(zhong)種蛋(dan)白(bai)酶抑(yi)制劑(ji)。
同壹(yi)蛋(dan)白(bai)樣(yang)品能(neng)同時進(jin)行(xing)兩種因子的(de)Western Blot檢測(ce)，有的(de)甚至(zhi)可(ke)以(yi)同時測幾(ji)十種樣品。
如果(guo)是膜(mo)蛋(dan)白(bai)和(he)胞漿蛋(dan)白(bai)，所用(yong)的(de)去垢(gou)劑(ji)就(jiu)要溫和得(de)多，這(zhe)時加(jia)上(shang)NaF去抑(yi)制磷#化(hua)酶的(de)活(huo)性(xing)。
樣品的(de)蛋(dan)白(bai)含(han)量很低，每(mei)微升(sheng)不到(dao)微克(ke)，但是在轉(zhuan)膜時經常(chang)會(hui)發現(xian)只(zhi)有壹(yi)部分蛋(dan)白(bai)轉(zhuan)到(dao)了膜上(shang)，就是(shi)在轉(zhuan)膜後(hou)染膠發現(xian)有的(de)孔(kong)所有的(de)蛋(dan)白(bai)條帶都(dou)在，只是(shi)顏色變(bian)淡(dan)了，可以(yi)加(jia)大(da)上(shang)樣量，轉(zhuan)移時可以(yi)用(yong)減(jian)少(shao)電(dian)流(liu)延長(chang)時間，多(duo)加(jia)5-0%甲(jia)醇(chun)。
想分離(li)的(de)蛋(dan)白(bai)是(shi)分(fen)子(zi)量260kd的(de)，SDS-PAGE電泳(yong)的(de)分離(li)膠(jiao)濃(nong)度用(yong)6%，Stacking Gel 3.5%，但260kd的(de)蛋(dan)白(bai)不(bu)好(hao)做(zuo)
如果上(shang)樣量超(chao)載(zai)，可以(yi)濃(nong)縮(suo)樣(yang)品，也可(ke)以根(gen)據(ju)妳(ni)的(de)目(mu)標(biao)分子(zi)量透(tou)析(xi)掉(diao)壹(yi)部分小(xiao)分(fen)子(zi)蛋(dan)白(bai)。壹(yi)般(ban)地(di)，超載(zai)30%是不(bu)會(hui)有問(wen)題(ti)的(de)。如果(guo)已經超(chao)了不少(shao)了，而且(qie)小(xiao)分(fen)子(zi)量的(de)也要，可以考慮(lv)加(jia)大(da)膠(jiao)的(de)厚(hou)度，可以(yi)試(shi)試(shi).5mm的(de) comb。
蛋(dan)白(bai)變(bian)性(xing)後(hou)存(cun)放-80℃，壹(yi)兩年(nian)沒有問(wen)題(ti)，zui關鍵兩條：不(bu)要被(bei)蛋(dan)白(bai)酶水(shui)解(jie)掉(diao);不(bu)要被(bei)細菌消(xiao)化(hua)掉(diao)（也(ye)是(shi)被(bei)酶水(shui)解(jie)了）。
采用(yong)DAB顯(xian)色(se)技(ji)術(shu)，二(er)抗是(shi)化(hua)的(de)多克(ke)隆(long)抗(kang)體，三抗是(shi)親(qin)和(he)素(su)體系，不(bu)能(neng)使(shi)用(yong)脫(tuo)脂(zhi)奶(nai)粉，脫脂(zhi)奶粉會影響親(qin)和(he)素(su)的(de)生成(cheng)，因為脫(tuo)脂(zhi)奶粉中含(han)，用(yong)BSA代(dai)替(ti)應該(gai)好壹(yi)點(dian).
Western Blot壹(yi)般(ban)上(shang)樣30-00微(wei)克(ke)不(bu)等，結(jie)果跟目(mu)的(de)蛋(dan)白(bai)的(de)豐度、上(shang)樣量、壹(yi)二(er)抗的(de)量和(he)撫(fu)育時間都(dou)有關(guan)系(xi)，也與(yu)顯(xian)色(se)時間長(chang)短(duan)有關(guan)。開(kai)始摸條件(jian)時，為了拿(na)到(dao)陽(yang)性(xing)結果(guo)，各(ge)個(ge)步驟(zhou)都(dou)可以(yi)量多(duo)壹(yi)點(dian)時間長(chang)壹(yi)點(dian)，當(dang)然(ran)背(bei)景也(ye)就(jiu)出(chu)來了。要拿(na)到(dao)好的(de)結果(guo)，如(ru)果(guo)抗體好的(de)話比(bi)較(jiao)容易(yi)，抗體不好(hao)的(de)話就(jiu)需(xu)要反(fan)復(fu)地(di)試(shi)了，當(dang)然(ran)有的(de)不適(shi)合(he)Western Blot的(de)怎樣做(zuo)也不(bu)行(xing)。所以拿(na)到(dao)好的(de)結果(guo)不(bu)容易(yi)。