【概要描(miao)述(shu)】鼠(shu)抗人(ren)Bax單克(ke)隆抗體(ti) Bax Western免疫(yi)印跡(ji)(Western Blot)是將(jiang)蛋(dan)白質(zhi)轉(zhuan)移(yi)到(dao)膜上，然(ran)後(hou)利(li)用(yong)抗(kang)體(ti)進行(xing)檢(jian)測。

鼠(shu)抗人(ren)Bax單克(ke)隆抗體(ti) Bax Western Blot技術(shu): 做(zuo)線(xian)粒(li)體(ti)膜UCP2蛋(dan)白的Western Blot （以下簡寫成(cheng)Western Blot），提取(qu)線粒(li)體(ti)後(hou)凍(dong)存(cun)（未(wei)加蛋白酶(mei)抑(yi)制劑），樣品(pin)不能反復凍(dong)融(rong);，加蛋(dan)白酶(mei)抑(yi)制劑。同(tong)時，建議(yi)檢(jian)查(zha)Western Blot過(guo)程， 提高壹(yi)抗濃(nong)度(du)。對於(yu)加(jia)蛋(dan)白酶(mei)抑(yi)制劑來說(shuo)，壹(yi)般加PMSF就(jiu)可以了(le)，能(neng)多(duo)加幾中(zhong)種(zhong)蛋(dan)白酶(mei)抑(yi)制劑。
同(tong)壹(yi)蛋白樣品(pin)能(neng)同(tong)時進行(xing)兩種(zhong)因(yin)子(zi)的Western Blot檢(jian)測，有(you)的甚(shen)至(zhi)可以同(tong)時測幾十種(zhong)樣 鼠(shu)抗人(ren)Bax單克(ke)隆抗體(ti) Bax  如果(guo)是(shi)膜(mo)蛋(dan)白和(he)胞(bao)漿(jiang)蛋白，所(suo)用(yong)的去垢(gou)劑就(jiu)要溫(wen)和(he)得多(duo)，這時加上NaF去抑制(zhi)磷#化(hua)酶(mei)的活性(xing)。
樣品(pin)的蛋白含(han)量(liang)很(hen)低，每微升(sheng)不到(dao)微克(ke)，但是(shi)在(zai)轉(zhuan)膜時經(jing)常會發(fa)現只有(you)壹(yi)部分(fen)蛋(dan)白轉(zhuan)到(dao)了膜(mo)上，就(jiu)是在(zai)轉(zhuan)膜後(hou)染(ran)膠(jiao)發(fa)現(xian)有(you)的孔所(suo)有(you)的蛋白條(tiao)帶(dai)都在(zai)，只是(shi)顏(yan)色(se)變(bian)淡了(le)，可以加(jia)大(da)上樣量(liang)，轉(zhuan)移(yi)時可以用(yong)減(jian)少電(dian)流延長(chang)時間，多加5-0%甲醇(chun)。
想分(fen)離(li)的蛋白是(shi)分(fen)子(zi)量(liang)260kd的，SDS-PAGE電泳(yong)的分(fen)離(li)膠(jiao)濃(nong)度(du)用(yong)6%，Stacking Gel 3.5%，但(dan)260kd的蛋白不好做(zuo)
如(ru)果(guo)上樣量(liang)超載，可以濃(nong)縮樣品(pin)，也(ye)可以根(gen)據妳的目標(biao)分(fen)子(zi)量(liang)透(tou)析(xi)掉壹(yi)部分(fen)小(xiao)分(fen)子(zi)蛋(dan)白。壹(yi)般地，超載30%是(shi)不會有(you)問題的。如果(guo)已(yi)經(jing)超了不少了(le)，而(er)且(qie)小(xiao)分(fen)子(zi)量(liang)的也(ye)要，可以考(kao)慮加(jia)大膠(jiao)的厚度(du)，可以試試.5mm的 comb。
蛋白變(bian)性(xing)後(hou)存(cun)放(fang)-80℃，壹(yi)兩年沒有(you)問題，zui關(guan)鍵兩條(tiao)：不要被(bei)蛋(dan)白酶(mei)水(shui)解掉;不要被(bei)細(xi)菌消化(hua)掉（也(ye)是(shi)被(bei)酶(mei)水解了）。
采用(yong)DAB顯(xian)色(se)技(ji)術(shu)，二抗是化(hua)的多克(ke)隆抗體(ti)，三(san)抗(kang)是親和素(su)體(ti)系(xi)，不能使(shi)用(yong)脫(tuo)脂奶粉(fen)，脫(tuo)脂奶粉(fen)會影(ying)響(xiang)親(qin)和(he)素(su)的生成(cheng)，因(yin)為脫(tuo)脂奶粉(fen)中(zhong)含(han)，用(yong)BSA代(dai)替應(ying)該(gai)好(hao)壹(yi)點. Bax  Western Blot壹(yi)般上樣30-00微(wei)克(ke)不等，結果(guo)跟(gen)目(mu)的蛋白的豐(feng)度、上樣量(liang)、壹(yi)二抗的量(liang)和(he)撫育時間都有(you)關系(xi)，也(ye)與(yu)顯(xian)色(se)時間長(chang)短有(you)關。開始摸(mo)條件(jian)時，為了拿到(dao)陽性(xing)結果(guo)，各(ge)個步(bu)驟(zhou)都可以量(liang)多(duo)壹(yi)點時間長(chang)壹(yi)點，當然(ran)背景也(ye)就(jiu)出(chu)來(lai)了。要拿到(dao)好的結果(guo)，如(ru)果(guo)抗(kang)體(ti)好的話比(bi)較容易，抗(kang)體(ti)不好的話就(jiu)需(xu)要反復地(di)試了(le)，當(dang)然(ran)有(you)的不適(shi)合(he)Western Blot的怎樣做(zuo)也(ye)不行(xing)。所以拿到(dao)好的結果(guo)不容易。

  Bax 壹(yi)、 原(yuan)理

與Southern或Northern雜(za)交(jiao)方法(fa)類(lei)似，但(dan)Western Blot采用(yong)的是聚(ju)丙烯(xi)酰胺凝膠電(dian)泳(yong)，被(bei)檢(jian)測物(wu)是蛋(dan)白質(zhi)，“探針(zhen)”是抗(kang)體(ti)，“顯(xian)色(se)”用(yong)標(biao)記的二抗。經(jing)過(guo)PAGE分(fen)離(li)的蛋白質(zhi)樣品(pin)，轉(zhuan)移(yi)到(dao)固相(xiang)載體(ti)（例如(ru)硝#纖維(wei)素(su)薄(bo)膜(mo)）上，固相(xiang)載體(ti)以非(fei)共(gong)價(jia)鍵形式(shi)吸(xi)附(fu)蛋(dan)白質(zhi)，且(qie)能(neng)保(bao)持電(dian)泳(yong)分(fen)離(li)的多肽類(lei)型(xing)及其生(sheng)物(wu)學活性(xing)不變(bian)。以固(gu)相(xiang)載體(ti)上的蛋白質(zhi)或(huo)多肽作(zuo)為抗原(yuan)，與(yu)對應的抗體(ti)起免(mian)疫(yi)反應(ying)，再(zai)與酶(mei)或同(tong)位(wei)素(su)標記(ji)的第(di)二抗體(ti)起反應(ying)，經(jing)過(guo)底(di)物(wu)顯(xian)色(se)或(huo)放(fang)射自顯(xian)影(ying)以檢(jian)測電(dian)泳(yong)分(fen)離(li)的特(te)異性(xing)目的基因(yin)表達(da)的蛋白成(cheng)分(fen)。該(gai)技(ji)術(shu)也(ye)廣泛(fan)應(ying)用(yong)於(yu)檢(jian)測蛋(dan)白水(shui)平(ping)的表達(da)。

二、分(fen)類(lei)  現(xian)常用(yong)的有(you)底物(wu)化(hua)學(xue)發(fa)光ECL和底(di)物(wu)DAB呈(cheng)色(se)，體(ti)同(tong)水(shui)平(ping)和實(shi)驗條件(jian)的是用(yong)*種(zhong)方法(fa)，目(mu)前(qian)發(fa)表文(wen)章通常是用(yong)底(di)物(wu)化(hua)學(xue)發(fa)光ECL。只要買(mai)現(xian)成(cheng)的試劑盒就(jiu)行(xing)，操作(zuo)也(ye)比(bi)較簡單，原(yuan)理如下（二抗用(yong)HRP標記(ji)）：反應(ying)底物(wu)為過(guo)氧(yang)化(hua)物(wu)+魯(lu)米諾(nuo)，如遇到(dao)HRP，即發(fa)光，可使膠(jiao)片曝(pu)光，就(jiu)可洗出(chu)條(tiao)帶。

三(san)、 主(zhu)要試劑

、 丙烯(xi)酰(xian)胺和(he)N，N’-亞(ya)甲雙丙烯(xi)酰(xian)胺，應以溫(wen)熱(re)（以利(li)於(yu)溶(rong)解雙丙稀酰胺(an)）的去離(li)子(zi)水(shui)配制含(han)有(you)29%（w/v）丙稀酰胺(an)和%（w/v）N，N’-亞(ya)甲雙丙烯(xi)酰(xian)胺儲(chu)存(cun)液(ye)丙稀酰胺(an)29g，N，N-亞(ya)甲叉雙丙稀酰胺(an)g，加H2O至(zhi) 00ml。）儲(chu)於(yu)棕色(se)瓶，4℃避光保(bao)存(cun)。嚴(yan)格(ge)核實(shi)PH不得超過(guo)7.0，因(yin)可以發(fa)生(sheng)脫(tuo)氨(an)基反應(ying)是光催(cui)化(hua)或(huo)堿(jian)催(cui)化(hua)的。使用(yong)期不得超過(guo)兩(liang)個月，隔幾個(ge)月(yue)須(xu)重新配制。如(ru)有(you)沈澱(dian)，可以過(guo)濾(lv)。  2、 十二烷基硫(liu)#鈉(na)SDS溶(rong)液(ye):0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去離(li)子(zi)水(shui)配制，室(shi)溫保(bao)存(cun)。

3、 分(fen)離(li)膠(jiao)緩(huan)沖液(ye):.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和48mlmol/L HCl 混合(he)，加水(shui)稀釋到(dao)00ml終體(ti)積。過(guo)濾(lv)後(hou)40℃保(bao)存(cun)。

4、 濃(nong)縮膠緩沖液(ye):0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶(rong)於(yu)40mlH2O中(zhong)，用(yong)約48ml mol/L HCl調(tiao)至(zhi)pH6.8加水(shui)稀釋到(dao)00ml終體(ti)積。過(guo)濾(lv)後(hou)40C保(bao)存(cun)。這兩(liang)種(zhong)緩(huan)沖液(ye)必(bi)須(xu)使(shi)用(yong)Tris堿(jian)制備，再(zai)用(yong)HCL調(tiao)節PH值(zhi)，而(er)不用(yong) Tris.CL。

5、 TEMED原(yuan)溶(rong)液(ye)N，N，N’N’四甲基乙(yi)二胺催(cui)化(hua)過(guo)硫(liu)#銨形(xing)成(cheng)自由(you)基(ji)而(er)加(jia)速(su)兩種(zhong)丙(bing)稀酰胺(an)的聚(ju)合(he)。PH太低(di)時，聚(ju)合(he)反應(ying)受到(dao)抑制(zhi)。0%（w/v）過(guo)硫(liu)#胺溶(rong)液(ye)。提供兩(liang)種(zhong)丙(bing)稀酰胺(an)聚(ju)合(he)所必(bi)須(xu)的自由(you)基(ji)。去離(li)子(zi)水(shui)配制數(shu)ml，臨用(yong)前(qian)配制.

6、 SDS- PAGE加樣緩(huan)沖液(ye):pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖液(ye)8ml，甘(gan)油6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰基(ji)乙(yi)醇(chun)3.2ml，0.05%溴酚藍.6ml，H2O 32ml混勻備用(yong)。按(an):或:2比例(li)與(yu)蛋白質(zhi)樣品(pin)混(hun)合(he)，在(zai)沸水終(zhong)煮3min混勻後(hou)再(zai)上樣，壹(yi)般為20-25ul，總(zong)蛋(dan)白量(liang)00μg。

7、 Tris-甘(gan)氨#電泳(yong)緩(huan)沖液(ye):30.3gTris，88g甘(gan)氨#，0gSDS，用(yong)蒸(zheng)餾水(shui)溶(rong)解至(zhi)000ml，得0.25mol/L Tris-.92mol/L甘(gan)氨#電極(ji)緩(huan)沖液(ye)。臨用(yong)前(qian)稀釋0倍。

8、 轉(zhuan)移(yi)緩(huan)沖液(ye)：配制L轉(zhuan)移(yi)緩(huan)沖液(ye)，需(xu)稱取(qu)2.9g甘(gan)氨#、5.8gTris堿(jian)、0.37g SDS，並(bing)加入(ru)200ml甲醇(chun)，加水(shui)至(zhi)總(zong)量(liang)L。

9、 麗(li)春(chun)紅(hong)染液(ye)儲(chu)存(cun)液(ye)：麗(li)春(chun)紅(hong)S 2g 三(san)#乙(yi)#30g 磺基(ji)水(shui)楊# 30g 加水(shui)至(zhi)00ml 用(yong)時上述儲(chu)存(cun)液(ye)稀釋0倍即(ji)成(cheng)麗(li)春(chun)紅(hong)S使用(yong)液(ye)。使用(yong)後(hou)應(ying)予以廢棄。

0、 脫(tuo)脂奶粉(fen)5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊氮鈉(na)（有(you)毒，戴(dai)手(shou)套(tao)操作(zuo)），溶(rong)於(yu)磷#緩沖鹽(yan)溶(rong)液(ye)（PBS）。

2、 Tris緩沖鹽(yan)溶(rong)液(ye)（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠(shu)抗人(ren)-MMP-9（6）鼠(shu)抗人(ren)-TIMP-。

4、 過(guo)氧(yang)化(hua)物(wu)酶標(biao)記的第(di)二抗體(ti)。

5、 NBT（溶(rong)於(yu)70%二甲基甲酰胺，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶(rong)於(yu)00%二甲基甲酰胺，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。