【概要描述(shu)】兔(tu)抗(kang)人(ren)Bax多克(ke)隆(long)抗體 Bax Western Blot)是將蛋(dan)白質(zhi)轉(zhuan)移(yi)到膜(mo)上，然後(hou)利(li)用抗體進(jin)行檢(jian)測(ce)。

兔抗(kang)人(ren)Bax多克(ke)隆(long)抗體 Bax Western Blot技(ji)術:

壹(yi)、 原(yuan)理(li)

與(yu)Southern或Northern雜交(jiao)方(fang)法(fa)類似，但(dan)Western Blot采用(yong)的(de)是聚丙烯酰(xian)胺凝膠(jiao)電(dian)泳，被(bei)檢測(ce)物(wu)是蛋(dan)白質(zhi)，“探針(zhen)”是抗(kang)體，“顯(xian)色”用標(biao)記(ji)的(de)二抗(kang)。經過PAGE分離(li)的(de)蛋(dan)白質(zhi)樣(yang)品，轉(zhuan)移(yi)到固相(xiang)載體（例(li)如硝#纖維(wei)素(su)薄(bo)膜(mo)）上，固(gu)相載(zai)體以非(fei)共(gong)價鍵形(xing)式吸(xi)附(fu)蛋(dan)白質(zhi)，且(qie)能(neng)保(bao)持(chi)電(dian)泳分離(li)的(de)多肽類型(xing)及(ji)其(qi)生(sheng)物學(xue)活性(xing)不變。以固相(xiang)載體上的(de)蛋(dan)白質(zhi)或多肽作(zuo)為抗(kang)原(yuan)，與(yu)對(dui)應(ying)的(de)抗體起(qi)免疫(yi)反應，再(zai)與(yu)酶(mei)或同位(wei)素(su)標(biao)記(ji)的(de)第二(er)抗體起(qi)反應，經過底(di)物(wu)顯(xian)色或放射自(zi)顯(xian)影以檢測(ce)電(dian)泳分離(li)的(de)特異(yi)性(xing)目(mu)的(de)基因表達(da)的(de)蛋(dan)白成(cheng)分。該技(ji)術也(ye)廣(guang)泛(fan)應用於(yu)檢測(ce)蛋(dan)白水平的(de)表達(da)。

二、分類 兔(tu)抗人(ren)Bax多克(ke)隆(long)抗體 Bax 現常(chang)用(yong)的(de)有底(di)物化(hua)學(xue)發(fa)光ECL和(he)底物DAB呈色，體同水平和(he)實(shi)驗(yan)條件的(de)是用(yong)*種(zhong)方(fang)法(fa)，目(mu)前(qian)發(fa)表文章(zhang)通常(chang)是用(yong)底(di)物化(hua)學(xue)發(fa)光ECL。只要買(mai)現成(cheng)的(de)試劑(ji)盒就(jiu)行，操(cao)作(zuo)也(ye)比較(jiao)簡單，原(yuan)理(li)如下（二抗(kang)用HRP標記(ji)）：反應底(di)物為過氧(yang)化(hua)物(wu)+魯(lu)米(mi)諾(nuo)，如遇(yu)到HRP，即(ji)發(fa)光，可(ke)使膠(jiao)片(pian)曝(pu)光，就(jiu)可(ke)洗(xi)出(chu)條帶(dai)。

三、 主要試劑(ji)

、 丙烯酰(xian)胺和(he)N，N’-亞甲(jia)雙(shuang)丙烯酰(xian)胺，應以溫(wen)熱（以利於(yu)溶(rong)解雙(shuang)丙稀酰(xian)胺）的(de)去離(li)子水配制含有29%（w/v）丙稀酰(xian)胺和(he)%（w/v）N，N’-亞甲(jia)雙(shuang)丙烯酰(xian)胺儲存(cun)液(ye)丙稀酰(xian)胺29g，N，N-亞甲(jia)叉(cha)雙(shuang)丙稀酰(xian)胺g，加(jia)H2O至 00ml。）儲於(yu)棕色瓶(ping)，4℃避光保(bao)存(cun)。嚴格(ge)核(he)實(shi)PH不得(de)超(chao)過7.0，因可(ke)以發(fa)生(sheng)脫氨(an)基反應是光催(cui)化(hua)或堿(jian)催(cui)化(hua)的(de)。使用(yong)期不得(de)超(chao)過兩(liang)個月，隔(ge)幾(ji)個月須(xu)重新配制。如有沈澱，可(ke)以過濾(lv)。 Bax 2、 十二(er)烷(wan)基硫(liu)#鈉SDS溶(rong)液(ye):0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去離(li)子水配制，室(shi)溫(wen)保(bao)存(cun)。

3、 分離(li)膠(jiao)緩沖液(ye):.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和(he)48mlmol/L HCl 混合，加(jia)水稀釋到00ml終體積(ji)。過濾(lv)後(hou)40℃保(bao)存(cun)。

4、 濃(nong)縮膠(jiao)緩沖液(ye):0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶(rong)於(yu)40mlH2O中(zhong)，用(yong)約(yue)48ml mol/L HCl調至(zhi)pH6.8加(jia)水稀釋到00ml終體積(ji)。過濾(lv)後(hou)40C保(bao)存(cun)。這兩(liang)種(zhong)緩沖液(ye)必(bi)須(xu)使用(yong)Tris堿(jian)制備，再(zai)用HCL調節(jie)PH值，而(er)不用 Tris.CL。

5、 TEMED原(yuan)溶(rong)液(ye)N，N，N’N’四甲(jia)基乙(yi)二胺催(cui)化(hua)過硫(liu)#銨形(xing)成(cheng)自(zi)由基而(er)加(jia)速(su)兩(liang)種(zhong)丙稀酰(xian)胺的(de)聚合。PH太低時，聚合反應受到抑(yi)制。0%（w/v）過硫(liu)#胺溶(rong)液(ye)。提供(gong)兩(liang)種(zhong)丙稀酰(xian)胺聚合所(suo)必(bi)須(xu)的(de)自(zi)由基。去離(li)子水配制數(shu)ml，臨用(yong)前配制.

6、 SDS- PAGE加(jia)樣緩沖液(ye):pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖液(ye)8ml，甘油(you)6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰基乙(yi)醇3.2ml，0.05%溴(xiu)酚藍(lan).6ml，H2O 32ml混勻備(bei)用(yong)。按:或:2比例(li)與(yu)蛋(dan)白質(zhi)樣(yang)品混合，在(zai)沸(fei)水終煮3min混勻後(hou)再(zai)上樣(yang)，壹(yi)般為20-25ul，總蛋(dan)白量(liang)00μg。

7、 Tris-甘氨(an)#電(dian)泳緩沖液(ye):30.3gTris，88g甘氨(an)#，0gSDS，用蒸(zheng)餾水溶(rong)解至000ml，得(de)0.25mol/L Tris-.92mol/L甘氨(an)#電(dian)極緩沖液(ye)。臨用(yong)前稀(xi)釋0倍。

8、 轉(zhuan)移(yi)緩沖液(ye)：配制L轉(zhuan)移(yi)緩沖液(ye)，需(xu)稱取2.9g甘氨(an)#、5.8gTris堿(jian)、0.37g SDS，並(bing)加(jia)入200ml甲醇(chun)，加(jia)水至總量L。

9、 麗(li)春紅(hong)染液(ye)儲存(cun)液(ye)：麗(li)春紅(hong)S 2g 三#乙(yi)#30g 磺基水楊# 30g 加(jia)水至00ml 用時上述(shu)儲(chu)存(cun)液(ye)稀釋0倍即(ji)成(cheng)麗(li)春紅(hong)S使用(yong)液(ye)。使用(yong)後(hou)應(ying)予以廢棄(qi)。

0、 脫脂奶(nai)粉5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊氮鈉（有毒(du)，戴(dai)手(shou)套操(cao)作(zuo)），溶(rong)於(yu)磷#緩沖鹽(yan)溶(rong)液(ye)（PBS）。

2、 Tris緩沖鹽(yan)溶(rong)液(ye)（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠抗(kang)人(ren)-MMP-9（6）鼠抗(kang)人(ren)-TIMP-。

4、 過氧(yang)化(hua)物(wu)酶(mei)標(biao)記(ji)的(de)第二(er)抗體。

5、 NBT（溶(rong)於(yu)70%二甲(jia)基甲(jia)酰(xian)胺，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶(rong)於(yu)00%二甲(jia)基甲(jia)酰(xian)胺，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。