【概要(yao)描(miao)述(shu)】鼠(shu)抗(kang)人(ren)多(duo)藥耐藥基因單克隆(long)抗(kang)體 MDR- Western Blot)是將(jiang)蛋(dan)白質(zhi)轉(zhuan)移到膜上，然後利(li)用(yong)抗(kang)體進行檢測。

鼠抗(kang)人(ren)多(duo)藥耐藥基因單克隆(long)抗(kang)體 MDR-   Western Blot技術:

LOP48    鼠(shu)抗(kang)人(ren)CD44變(bian)異(yi)體（V4）單克(ke)隆(long)抗(kang)體    CD44V4
LOP49    鼠抗(kang)人(ren)CD44變(bian)異(yi)體（V5）單克(ke)隆(long)抗(kang)體    CD44V5 
LOP50    鼠抗(kang)人(ren)CD44變(bian)異(yi)體（V6）單克(ke)隆(long)抗(kang)體    CD44V6
LOP58    鼠抗(kang)人(ren)CD5單(dan)克隆(long)抗(kang)體    CD5
LOP59    兔抗(kang)人(ren)外套(tao)層細胞(bao)淋巴(ba)瘤(liu)標(biao)記(ji)    CD5  Associated lycoprotein（TAG-72）
LOP5 鼠抗(kang)人(ren)酶(mei)單克(ke)隆(long)抗(kang)體 Tyrosinase
鼠抗(kang)人(ren)多(duo)藥耐藥基因單克隆(long)抗(kang)體 MDR-    壹(yi)、 原(yuan)理(li)

與(yu)Southern或Northern雜交(jiao)方(fang)法類似(si)，但(dan)Western Blot采用(yong)的是聚丙(bing)烯(xi)酰胺凝膠(jiao)電(dian)泳，被檢測物(wu)是蛋白質(zhi)，“探針(zhen)”是抗(kang)體，“顯色(se)”用(yong)標記(ji)的二(er)抗(kang)。經(jing)過(guo)PAGE分離(li)的(de)蛋(dan)白質(zhi)樣品(pin)，轉移到固(gu)相載(zai)體（例(li)如硝(xiao)#纖維(wei)素(su)薄(bo)膜）上，固(gu)相載(zai)體以非(fei)共(gong)價(jia)鍵形式吸(xi)附蛋(dan)白質(zhi)，且(qie)能保持(chi)電(dian)泳分離的多(duo)肽(tai)類型(xing)及(ji)其(qi)生物(wu)學(xue)活性(xing)不變(bian)。以(yi)固(gu)相載(zai)體上的蛋(dan)白質(zhi)或(huo)多(duo)肽(tai)作為抗(kang)原(yuan)，與(yu)對(dui)應(ying)的(de)抗(kang)體起免疫反(fan)應(ying)，再(zai)與(yu)酶(mei)或同位(wei)素標記(ji)的第(di)二(er)抗(kang)體起反(fan)應(ying)，經(jing)過(guo)底(di)物(wu)顯色或放射(she)自顯影(ying)以(yi)檢測電(dian)泳分離的特異性(xing)目(mu)的(de)基(ji)因表達(da)的(de)蛋(dan)白成分(fen)。該技術也廣(guang)泛應(ying)用(yong)於檢測蛋白水(shui)平(ping)的表(biao)達(da)。

LOP5    鼠(shu)抗(kang)人(ren)CD45 RA,B細(xi)胞(bao)單克(ke)隆(long)抗(kang)體    CD45 RA,B Cell 
LOP52    鼠抗(kang)人(ren)CD45（LCA）單(dan)克隆(long)抗(kang)體    CD45（LCA） 
LOP53    鼠抗(kang)人(ren)CD45RA（B細(xi)胞(bao)）單克(ke)隆(long)抗(kang)體    CD45RA
LOP54    鼠抗(kang)人(ren)CD45RB（B細(xi)胞(bao)）單克(ke)隆(long)抗(kang)體    CD45RB 
LOP55    鼠抗(kang)人(ren)CD45RO（T細(xi)胞(bao)）單克(ke)隆(long)抗(kang)體    CD45RO  
LOP56    鼠抗(kang)人(ren)CD45 RO,T細(xi)胞(bao)單克(ke)隆(long)抗(kang)體    CD45RO T Cell OPD4 
LOP57    鼠抗(kang)人(ren)CD45 RO,T細(xi)胞(bao)單克(ke)隆(long)抗(kang)體    CD45RO T Cell UCHL  
二(er)、分類 MDR-   現(xian)常(chang)用(yong)的有底(di)物(wu)化(hua)學(xue)發光(guang)ECL和底(di)物(wu)DAB呈色(se)，體同水(shui)平(ping)和實(shi)驗(yan)條件的(de)是(shi)用(yong)*種方(fang)法，目(mu)前(qian)發(fa)表(biao)文章(zhang)通常(chang)是用(yong)底(di)物(wu)化(hua)學(xue)發光(guang)ECL。只要(yao)買(mai)現(xian)成的試(shi)劑(ji)盒就行，操作也比較簡(jian)單，原(yuan)理(li)如下(xia)（二(er)抗(kang)用(yong)HRP標記(ji)）：反應(ying)底(di)物(wu)為過氧(yang)化(hua)物(wu)+魯米(mi)諾(nuo)，如遇到(dao)HRP，即(ji)發(fa)光，可使膠(jiao)片(pian)曝(pu)光，就(jiu)可洗出條帶。

三(san)、 主(zhu)要(yao)試(shi)劑(ji)

、 丙烯(xi)酰胺和(he)N，N’-亞(ya)甲(jia)雙(shuang)丙(bing)烯(xi)酰胺，應(ying)以(yi)溫(wen)熱(re)（以利(li)於(yu)溶(rong)解雙(shuang)丙稀酰胺）的去(qu)離(li)子(zi)水(shui)配(pei)制含(han)有29%（w/v）丙稀(xi)酰胺和(he)%（w/v）N，N’-亞(ya)甲(jia)雙(shuang)丙(bing)烯(xi)酰胺儲(chu)存(cun)液丙稀酰胺29g，N，N-亞(ya)甲(jia)叉(cha)雙(shuang)丙(bing)稀(xi)酰胺g，加(jia)H2O至 00ml。）儲於(yu)棕(zong)色(se)瓶，4℃避光(guang)保存(cun)。嚴(yan)格(ge)核(he)實(shi)PH不得(de)超(chao)過(guo)7.0，因可以(yi)發(fa)生脫氨基反(fan)應(ying)是(shi)光(guang)催(cui)化(hua)或堿(jian)催化(hua)的。使用(yong)期不得(de)超過(guo)兩(liang)個月，隔(ge)幾(ji)個(ge)月須(xu)重新(xin)配(pei)制。如有沈(chen)澱(dian)，可以(yi)過(guo)濾(lv)。 MDR-   2、 十(shi)二(er)烷基硫(liu)#鈉(na)SDS溶(rong)液:0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去離(li)子(zi)水(shui)配(pei)制，室(shi)溫(wen)保存(cun)。

3、 分離(li)膠(jiao)緩沖(chong)液:.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和48mlmol/L HCl 混合(he)，加(jia)水(shui)稀(xi)釋(shi)到(dao)00ml終體積。過(guo)濾(lv)後40℃保存(cun)。

4、 濃縮(suo)膠(jiao)緩沖(chong)液:0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶(rong)於40mlH2O中(zhong)，用(yong)約48ml mol/L HCl調(tiao)至(zhi)pH6.8加(jia)水(shui)稀(xi)釋(shi)到(dao)00ml終體積。過(guo)濾(lv)後40C保存(cun)。這(zhe)兩種緩沖(chong)液必須(xu)使用(yong)Tris堿制(zhi)備，再(zai)用(yong)HCL調(tiao)節(jie)PH值，而不(bu)用(yong) Tris.CL。

5、 TEMED原(yuan)溶(rong)液N，N，N’N’四甲(jia)基(ji)乙(yi)二(er)胺催(cui)化(hua)過硫(liu)#銨(an)形成(cheng)自由基而加(jia)速兩種丙(bing)稀(xi)酰胺的(de)聚合(he)。PH太低時，聚合(he)反(fan)應(ying)受(shou)到(dao)抑(yi)制。0%（w/v）過硫(liu)#胺溶(rong)液。提(ti)供(gong)兩種丙(bing)稀(xi)酰胺聚合(he)所(suo)必須(xu)的自由基。去(qu)離(li)子水(shui)配(pei)制數(shu)ml，臨用(yong)前配(pei)制.

6、 SDS- PAGE加(jia)樣緩沖(chong)液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖(chong)液8ml，甘油(you)6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰基(ji)乙(yi)醇(chun)3.2ml，0.05%溴酚藍(lan).6ml，H2O 32ml混勻(yun)備用(yong)。按:或:2比例(li)與(yu)蛋(dan)白質(zhi)樣品(pin)混合(he)，在(zai)沸(fei)水(shui)終煮3min混勻(yun)後再(zai)上樣，壹(yi)般(ban)為(wei)20-25ul，總(zong)蛋白量00μg。

7、 Tris-甘氨#電(dian)泳緩沖(chong)液:30.3gTris，88g甘氨#，0gSDS，用(yong)蒸餾(liu)水(shui)溶(rong)解至(zhi)000ml，得0.25mol/L Tris-.92mol/L甘氨#電(dian)極(ji)緩沖(chong)液。臨用(yong)前稀釋(shi)0倍。

8、 轉移緩沖(chong)液：配(pei)制L轉移緩沖(chong)液，需稱取(qu)2.9g甘氨#、5.8gTris堿、0.37g SDS，並加(jia)入200ml甲(jia)醇(chun)，加(jia)水(shui)至(zhi)總(zong)量L。

9、 麗春(chun)紅(hong)染(ran)液儲存(cun)液：麗春(chun)紅(hong)S 2g 三(san)#乙#30g 磺基水(shui)楊# 30g 加(jia)水(shui)至(zhi)00ml 用(yong)時上述儲(chu)存(cun)液稀釋(shi)0倍即(ji)成(cheng)麗春(chun)紅(hong)S使用(yong)液。使用(yong)後應(ying)予以(yi)廢(fei)棄。

0、 脫脂(zhi)奶(nai)粉5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊氮鈉(na)（有毒(du)，戴手(shou)套(tao)操作），溶(rong)於磷(lin)#緩沖(chong)鹽(yan)溶(rong)液（PBS）。

2、 Tris緩沖(chong)鹽(yan)溶(rong)液（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠抗(kang)人(ren)-MMP-9（6）鼠抗(kang)人(ren)-TIMP-。

4、 過氧(yang)化(hua)物(wu)酶(mei)標記(ji)的第(di)二(er)抗(kang)體。

5、 NBT（溶(rong)於70%二(er)甲(jia)基(ji)甲(jia)酰胺，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶(rong)於00%二(er)甲(jia)基(ji)甲(jia)酰胺，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA MDR-  做線(xian)粒體膜UCP2蛋白的Western Blot （以(yi)下(xia)簡寫(xie)成Western Blot），提(ti)取(qu)線(xian)粒體後凍(dong)存(cun)（未(wei)加(jia)蛋白酶(mei)抑(yi)制劑(ji)），樣品(pin)不能反復凍(dong)融;，加(jia)蛋白酶(mei)抑(yi)制劑(ji)。同時(shi)，建(jian)議檢(jian)查Western Blot過程(cheng)， 提(ti)高(gao)壹(yi)抗(kang)濃度。對(dui)於加(jia)蛋白酶(mei)抑(yi)制劑(ji)來說(shuo)，壹(yi)般(ban)加(jia)PMSF就可以(yi)了，能多加(jia)幾中(zhong)種蛋(dan)白酶(mei)抑(yi)制劑(ji)。
同壹(yi)蛋(dan)白樣品(pin)能同時(shi)進(jin)行兩種因子的Western Blot檢測，有的甚(shen)至可以(yi)同時(shi)測幾十(shi)種樣品(pin)。
如果是(shi)膜蛋白和胞(bao)漿(jiang)蛋白，所用(yong)的去垢劑(ji)就要(yao)溫(wen)和(he)得多(duo)，這(zhe)時加(jia)上NaF去抑(yi)制磷(lin)#化(hua)酶(mei)的活(huo)性(xing)。
樣品(pin)的蛋白含量(liang)很低，每微升不(bu)到微克，但(dan)是在(zai)轉(zhuan)膜時經(jing)常(chang)會(hui)發(fa)現只有壹(yi)部(bu)分(fen)蛋(dan)白轉到(dao)了膜上，就是(shi)在(zai)轉(zhuan)膜後染(ran)膠(jiao)發現(xian)有的(de)孔所(suo)有的(de)蛋白條帶(dai)都(dou)在(zai)，只是顏(yan)色(se)變(bian)淡(dan)了，可以(yi)加(jia)大(da)上樣量(liang)，轉(zhuan)移時可以(yi)用(yong)減(jian)少(shao)電(dian)流(liu)延長(chang)時(shi)間，多加(jia)5-0%甲(jia)醇(chun)。
想分(fen)離(li)的蛋白是分(fen)子量(liang)260kd的，SDS-PAGE電(dian)泳的分離膠(jiao)濃度用(yong)6%，Stacking Gel 3.5%，但260kd的蛋(dan)白不好做
如果上樣量(liang)超(chao)載(zai)，可以(yi)濃縮(suo)樣品(pin)，也可以(yi)根據(ju)妳的目(mu)標(biao)分(fen)子(zi)量(liang)透析掉壹(yi)部(bu)分(fen)小分子(zi)蛋白。壹(yi)般(ban)地(di)，超(chao)載(zai)30%是不會有(you)問題的。如果已(yi)經(jing)超(chao)了不(bu)少(shao)了，而且(qie)小分子(zi)量的也要(yao)，可以(yi)考慮(lv)加(jia)大(da)膠(jiao)的厚度，可以(yi)試(shi)試(shi).5mm的(de) comb。
蛋(dan)白變(bian)性(xing)後存(cun)放-80℃，壹(yi)兩(liang)年(nian)沒(mei)有(you)問(wen)題，zui關鍵兩(liang)條(tiao)：不要(yao)被(bei)蛋(dan)白酶(mei)水(shui)解(jie)掉;不(bu)要(yao)被(bei)細(xi)菌(jun)消(xiao)化(hua)掉（也是被(bei)酶(mei)水(shui)解(jie)了）。
采用(yong)DAB顯色技(ji)術，二(er)抗(kang)是(shi)化(hua)的多(duo)克隆(long)抗(kang)體，三(san)抗(kang)是(shi)親(qin)和素體系，不(bu)能使用(yong)脫脂(zhi)奶(nai)粉，脫(tuo)脂(zhi)奶(nai)粉會(hui)影(ying)響(xiang)親(qin)和素的(de)生成，因為脫脂(zhi)奶(nai)粉中(zhong)含，用(yong)BSA代(dai)替(ti)應(ying)該好壹(yi)點(dian).
Western Blot壹(yi)般(ban)上樣30-00微克不(bu)等，結(jie)果跟(gen)目(mu)的(de)蛋(dan)白的豐度(du)、上樣量(liang)、壹(yi)二(er)抗(kang)的(de)量(liang)和撫育時間都(dou)有關系，也與(yu)顯(xian)色(se)時間長短(duan)有(you)關(guan)。開(kai)始(shi)摸(mo)條(tiao)件時(shi)，為(wei)了拿(na)到(dao)陽性(xing)結果，各個步驟(zhou)都(dou)可以(yi)量(liang)多壹(yi)點(dian)時(shi)間(jian)長(chang)壹(yi)點(dian)，當然背(bei)景也就出(chu)來了。要(yao)拿(na)到(dao)好的結(jie)果，如果抗(kang)體好的話(hua)比較容(rong)易(yi)，抗(kang)體不好的話(hua)就(jiu)需(xu)要(yao)反(fan)復(fu)地(di)試(shi)了，當然有(you)的(de)不適合(he)Western Blot的(de)怎(zen)樣做(zuo)也不行。所以(yi)拿到(dao)好的結(jie)果不(bu)容(rong)易(yi)。