【概要(yao)描(miao)述】兔(tu)滑膜細胞(bao)的(de)相(xiang)關(guan)產(chan)品(pin)：XWLC-05人肺腺(xian)癌細胞(bao)羊原(yuan)代主動脈平(ping)滑肌細胞(bao)大鼠原(yuan)代卵巢表面(mian)上皮(pi)細胞(bao)大鼠原(yuan)代骨骼(ge)肌成(cheng)纖(xian)維細胞(bao)兔(tu)原(yuan)代腎(shen)上腺皮(pi)質細胞(bao)兔(tu)原(yuan)代股(gu)動脈平(ping)滑肌細胞(bao)兔(tu)原(yuan)代胎盤(pan)間充(chong)質幹細胞(bao)人肌腱(jian)成纖(xian)維細胞(bao)小鼠原(yuan)代腦微血(xue)管周(zhou)細胞(bao)兔(tu)原(yuan)代肝竇內(nei)皮(pi)細胞(bao)

兔(tu)滑膜細胞(bao)

培(pei)養(yang)基 含FBS、生長添(tian)加(jia)劑(ji)、Penicillin、Streptomycin等

換(huan)液(ye)頻率(lv) 每(mei)2-3天換(huan)液(ye)壹次

生長特性(xing) 貼壁

細胞(bao)形態 成纖(xian)維細胞(bao)樣

傳代特性 可(ke)傳(chuan)5代左右；3代以內狀(zhuang)態

消(xiao)化液(ye) 0.25%yi蛋白酶

培(pei)養(yang)條(tiao)件(jian) 氣相(xiang)：空(kong)氣，95%；CO2，5%

兔(tu)滑膜分離自滑膜組織(zhi)；滑膜組織(zhi)是(shi)位於關(guan)節(jie)腔內面(mian)的(de)內(nei)襯結構(gou)，各(ge)種關(guan)節(jie)內(nei)疾病(bing)均會(hui)累(lei)及滑膜。而滑膜細胞(bao)是(shi)維持關(guan)節(jie)正(zheng)常功能(neng)的(de)重(zhong)要組織(zhi)結(jie)構，同(tong)時(shi)在各(ge)種關(guan)節(jie)疾患(huan)中(zhong)也(ye)是(shi)主要(yao)病(bing)變部位。骨(gu)關(guan)節(jie)炎(yan)（OA）以關(guan)節(jie)軟骨退(tui)行性變(bian)為特征，其病(bing)理改(gai)變(bian)累(lei)及關(guan)節(jie)的(de)各(ge)個組成部分，但絕不(bu)僅(jin)局(ju)限於軟骨，還包(bao)括軟骨下骨(gu)、滑膜、半(ban)月(yue)板(ban)和(he)韌(ren)帶(dai)。各組成部分的(de)病(bing)理改(gai)變(bian)相(xiang)互影響，相(xiang)互作用(yong)，共同(tong)加(jia)速(su)關(guan)節(jie)的(de)退(tui)變。滑膜細胞(bao)是(shi)構成(cheng)滑膜層的(de)最(zui)大細胞(bao)群(qun)體(ti)，是(shi)維持關(guan)節(jie)正(zheng)常功能(neng)的(de)重(zhong)要組織(zhi)結(jie)構，它(ta)包埋(mai)在顆(ke)粒狀(zhuang)無(wu)定(ding)性的(de)基質中(zhong)，基質內有(you)分(fen)散(san)的(de)纖(xian)維分布(bu)。滑膜由(you)A型(xing)（巨(ju)噬樣滑膜細胞(bao)）、B型(xing)（成(cheng)纖(xian)維樣滑膜細胞(bao)）以及C型(xing)（樹(shu)突(tu)細胞(bao)樣滑膜細胞(bao)）細胞(bao)組成。滑膜細胞(bao)主要功能(neng)：①滑膜細胞(bao)產(chan)生潤滑液(ye)成分(fen)，並且與(yu)關(guan)節(jie)腔的(de)吸(xi)收和血(xue)液(ye)/潤滑液(ye)交換(huan)有關(guan)；②滑膜細胞(bao)增生，表現為不依賴(lai)於支(zhi)持(chi)物(wu)生長，並且(qie)分泌(mi)大(da)量(liang)的(de)效(xiao)應分子來(lai)促(cu)進(jin)炎(yan)癥(zheng)和(he)關(guan)節(jie)損(sun)壞(huai)；③是(shi)自身(shen)自(zi)分泌(mi)和(he)旁分泌(mi)網(wang)絡(luo)中(zhong)效(xiao)應(ying)因子的(de)壹部分。
方法(fa)簡介(jie)：

公(gong)司實驗室(shi)分(fen)離的(de)兔(tu)滑膜采用(yong)混(hun)合(he)酶消(xiao)化法(fa)制備而(er)來(lai)，細胞(bao)總量(liang)約為5×10?cells/瓶(ping)。
質量(liang)檢測(ce)：

公(gong)司實驗室(shi)分(fen)離的(de)兔(tu)滑膜經Vimentin免疫(yi)熒(ying)光(guang)鑒定(ding)，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支(zhi)原(yuan)體、細菌、酵(jiao)母(mu)和(he)真(zhen)菌等(deng)。

壹、細胞(bao)培養

1取(qu)材(cai) 在無(wu)菌環(huan)境下從(cong)機(ji)體取(qu)出某(mou)種組織(zhi)細胞(bao)（視(shi)實驗目的(de)而(er)定(ding)），經過(guo)壹定(ding)的(de)處理（如消(xiao)化分(fen)散(san)細胞(bao)、分離等(deng)）後接(jie)入(ru)培養(yang)器血(xue)中(zhong)，這壹過(guo)程(cheng)稱(cheng)為取(qu)材(cai)。如是(shi)細胞(bao)株(zhu)的(de)擴(kuo)大培養(yang)則(ze)無(wu)取(qu)材(cai)這壹過(guo)程(cheng)。機(ji)體取(qu)出的(de)組織(zhi)細胞(bao)的(de)培(pei)養稱(cheng)為原(yuan)代培養。2培養(yang) 將(jiang)取(qu)得的(de)組織(zhi)細胞(bao)接(jie)入(ru)培養(yang)瓶(ping)或培養(yang)板(ban)中(zhong)的(de)過(guo)程(cheng)稱(cheng)為培養(yang)。3凍(dong)存及復蘇(su)（可(ke)參(can)閱後面(mian)有關(guan)章節(jie)）為了保(bao)存細胞(bao)，特別是(shi)不易(yi)獲得(de)的(de)突(tu)變型(xing)細胞(bao)或細胞(bao)株(zhu)，要將(jiang)細胞(bao)凍(dong)存。凍(dong)存的(de)溫(wen)度壹般用(yong)液(ye)氮的(de)溫(wen)度－196℃，將(jiang)細胞(bao)收集至(zhi)凍(dong)存管中(zhong)加(jia)入(ru)含保護劑(ji)（壹般為二甲(jia)亞碸或甘油(you)）的(de)培(pei)養基，以壹定(ding)的(de)冷卻速(su)度凍(dong)存，最終保(bao)存於液(ye)氮中(zhong)。在極(ji)低的(de)溫(wen)度下，細胞(bao)保存的(de)時(shi)間幾(ji)乎(hu)是(shi)無(wu)限的(de)。復蘇(su)壹般采用(yong)快(kuai)融方法(fa)，即從(cong)液(ye)氮中(zhong)取(qu)出凍(dong)存管後(hou)，立即放入(ru)37℃水中(zhong)，使(shi)之在壹分鐘內迅速(su)融解。然後(hou)將(jiang)細胞(bao)轉入(ru)培養(yang)器皿(min)中(zhong)進(jin)行(xing)培養。

二(er)、原(yuan)代細胞(bao)分離

凡(fan)是(shi)來(lai)源(yuan)於胚胎、組織(zhi)器官及外周(zhou)血(xue)，經特殊分(fen)離(li)方法(fa)制(zhi)備而(er)來(lai)的(de)原(yuan)初培養的(de)細胞(bao)稱(cheng)之為原(yuan)代細胞(bao)。1懸浮細胞(bao)的(de)分(fen)離方法(fa)組織(zhi)材(cai)料(liao)若(ruo)來(lai)自(zi)血(xue)液(ye)、羊水、胸水或腹水的(de)懸(xuan)液(ye)材(cai)料(liao)，的(de)方法(fa)是(shi)采用(yong)1000r/min的(de)低(di)速(su)離(li)心10分(fen)鐘(zhong)。經離心後(hou)由(you)於各種細胞(bao)的(de)比(bi)重(zhong)不同可(ke)在分(fen)層液(ye)中(zhong)形(xing)成(cheng)不同層，這樣可根據(ju)需(xu)要收(shou)獲目的(de)細胞(bao)。2實體(ti)組織(zhi)材(cai)料(liao)的(de)分(fen)離方法(fa)對(dui)於實體(ti)組織(zhi)材(cai)料(liao)，由(you)於細胞(bao)間結(jie)合(he)緊(jin)密，為了使(shi)組織(zhi)中(zhong)的(de)細胞(bao)充分分(fen)散(san)，形成(cheng)細胞(bao)懸液(ye)，可采用(yong)機(ji)械分(fen)散(san)法（物(wu)理裂解）和消(xiao)化分(fen)離法。

三、細胞(bao)增殖(zhi)檢(jian)測技術

目前主(zhu)要(yao)有(you)兩(liang)種用(yong)於檢測(ce)細胞(bao)增殖(zhi)能(neng)力的(de)方法(fa)。壹種是(shi)直接(jie)的(de)方法(fa)，通(tong)過(guo)直(zhi)接(jie)測定(ding)進行分(fen)裂

的(de)細胞(bao)數來(lai)評(ping)價細胞(bao)的(de)增(zeng)殖(zhi)能(neng)力。另壹種是(shi)間接(jie)的(de)方法(fa)，即細胞(bao)活力（cell viability）檢測(ce)方法(fa)，通(tong)過(guo)檢(jian)測(ce)樣品(pin)中(zhong)健康(kang)細胞(bao)的(de)數(shu)目來(lai)評(ping)價細胞(bao)的(de)增(zeng)殖(zhi)能(neng)力。顯然，細胞(bao)活力檢測(ce)法並(bing)不(bu)能(neng)最(zui)終(zhong)證明檢(jian)測(ce)樣品(pin)中(zhong)的(de)細胞(bao)是(shi)否在增(zeng)殖(zhi)。如細胞(bao)在某(mou)壹培養條(tiao)件(jian)下會(hui)自(zi)發(fa)啟(qi)動雕亡程(cheng)序(xu)，但藥物的(de)幹(gan)擾可抑制雕(diao)亡的(de)發(fa)生；這時(shi)若(ruo)采用(yong)細胞(bao)活力檢測(ce)法，顯然可以區分兩(liang)種條(tiao)件(jian)下的(de)細胞(bao)數量(liang)，但我們並不(bu)能(neng)從(cong)藥物幹擾組細胞(bao)數大於對照(zhao)組的(de)事(shi)實說(shuo)明藥物可促(cu)進(jin)細胞(bao)增殖(zhi)的(de)結(jie)論。所以最直接(jie)的(de)證據(ju)應(ying)該(gai)采用(yong)方法(fa)壹。

取(qu)材(cai)：首(shou)先(xian)，用(yong)培養液(ye)濕潤所取(qu)的(de)組織(zhi)材(cai)料(liao)，並(bing)用(yong)鋒利(li)的(de)眼(yan)科(ke)剪(jian)去(qu)除附(fu)在其上的(de)脂(zhi)肪和(he)結締組織(zhi)。接(jie)著(zhe)用(yong)平(ping)衡(heng)液(ye)（如PBS或Hanks液(ye)）漂洗(xi)，再用(yong)眼(yan)科(ke)彎(wan)剪(jian)將(jiang)組織(zhi)塊剪(jian)成小塊。多(duo)次用(yong)PBS或Hanks液(ye)漂洗(xi)，直到液(ye)體清(qing)亮、無(wu)油(you)滴(di)為止。

接(jie)種：用(yong)濕潤的(de)吸(xi)管吸(xi)取(qu)切碎(sui)的(de)組織(zhi)塊，輕(qing)輕吹(chui)到培(pei)養(yang)瓶(ping)皿(min)中(zhong)，並(bing)按(an)壹定(ding)間距均勻(yun)放(fang)在培(pei)養瓶(ping)底(di)壁上。註意不(bu)要(yao)過(guo)多(duo)，確(que)保(bao)組織(zhi)塊切(qie)面(mian)貼在培(pei)養瓶(ping)底(di)壁上。

培(pei)養：將(jiang)培(pei)養瓶(ping)翻(fan)轉(zhuan)，使(shi)瓶(ping)底(di)朝(chao)上，在種植(zhi)了(le)組織(zhi)塊壹側(ce)的(de)對(dui)側(ce)面(mian)加足(zu)培(pei)養液(ye)，避免組織(zhi)塊與(yu)培(pei)養(yang)液(ye)接(jie)觸，然(ran)後塞緊(jin)瓶(ping)塞(sai)。將(jiang)種植(zhi)了(le)組織(zhi)塊的(de)壹側(ce)朝上，靜置(zhi)於37℃培養(yang)箱(xiang)中(zhong)。待(dai)組織(zhi)塊貼(tie)壁1到3小時(shi)後(hou)翻(fan)瓶(ping)，使(shi)貼壁的(de)組織(zhi)塊浸沒在培(pei)養液(ye)中(zhong)，繼(ji)續(xu)靜置(zhi)。換(huan)液(ye)：每隔(ge)2到3天更(geng)換(huan)壹次培養液(ye)，或者根據(ju)培(pei)養(yang)瓶(ping)種顏色的(de)變(bian)化確定(ding)換(huan)液(ye)時(shi)間。

壹、原(yuan)代細胞(bao)計(ji)數

將(jiang)血(xue)球計(ji)數板(ban)及蓋片用(yong)擦試幹凈(jing)，並(bing)將(jiang)蓋(gai)片蓋在計(ji)數板(ban)上。

將(jiang)細胞(bao)懸液(ye)吸(xi)出少(shao)許，滴(di)加在蓋(gai)片邊緣，使(shi)懸液(ye)充滿(man)蓋片和計(ji)數板(ban)之(zhi)間。

靜置(zhi)3分(fen)鐘(zhong)。

鏡(jing)下觀(guan)察，計(ji)算計(ji)數板(ban)四(si)大格細胞(bao)總數(shu)，壓(ya)線(xian)細胞(bao)只(zhi)計(ji)左側(ce)和上方的(de)。然(ran)後按(an)下式(shi)計(ji)算：

細胞(bao)數/ml＝4大格(ge)細胞(bao)總數(shu)/ 4×10000

註意：鏡(jing)下偶見(jian)由(you)兩個以上細胞(bao)組成的(de)細胞(bao)團，應按(an)單(dan)個細胞(bao)計(ji)算，若(ruo)細胞(bao)團占10%以上，說明分(fen)散(san)不好，需(xu)重新(xin)制(zhi)備細胞(bao)懸液(ye)。

二、原(yuan)代細胞(bao)活力

將(jiang)細胞(bao)懸液(ye)以0.5ml加入(ru)試管中(zhong)。

加入(ru)0.5ml 0.4%臺(tai)盼蘭(lan)染(ran)液(ye)，染(ran)色2壹3分鐘。

吸(xi)取(qu)少(shao)許懸液(ye)塗(tu)於載(zai)玻片上，加上蓋片。

鏡(jing)下取(qu)幾個任意視(shi)野(ye)分別(bie)計(ji)死(si)細胞(bao)和活細胞(bao)數，計(ji)細胞(bao)活力。

死(si)細胞(bao)能(neng)被臺(tai)盼蘭(lan)染(ran)上色，鏡(jing)下可(ke)見(jian)深(shen)蘭(lan)色的(de)細胞(bao)，活細胞(bao)不被染(ran)色，鏡(jing)下呈無(wu)色透明狀(zhuang)。

活力測定(ding)可以和細胞(bao)計(ji)數合(he)起(qi)來(lai)進(jin)行(xing)，但要考慮(lv)到染(ran)液(ye)對原(yuan)細胞(bao)懸液(ye)的(de)加(jia)倍稀釋作用(yong)。