【概(gai)要(yao)描(miao)述(shu)】兔骺(hou)軟(ruan)骨細胞的相(xiang)關(guan)產(chan)品：PC-9/LUC人(ren)肺(fei)腺(xian)癌細胞豬(zhu)肺(fei)動脈(mai)平(ping)滑(hua)肌細(xi)胞大鼠原(yuan)代(dai)角質形成(cheng)細胞馬原(yuan)代骨骼(ge)肌(ji)細(xi)胞大鼠原(yuan)代(dai)神經(jing)膠(jiao)質(zhi)細胞大鼠原(yuan)代(dai)主(zhu)動脈(mai)弓(gong)平滑(hua)肌細(xi)胞雞睪丸支(zhi)持細胞豬(zhu)原(yuan)代骨骼(ge)肌(ji)細(xi)胞人(ren)原代(dai)臍(qi)靜(jing)脈內皮(pi)細胞小鼠原(yuan)代(dai)腹(fu)腔主(zhu)動脈(mai)內皮(pi)細胞

兔骺(hou)軟(ruan)骨細胞

培(pei)養(yang)基 含(han)FBS、生(sheng)長添加劑(ji)、Penicillin、Streptomycin等(deng)

換(huan)液頻率(lv) 每(mei)3-4天換(huan)液壹次

生(sheng)長特性(xing) 貼(tie)壁

細胞形態 梭形(xing)、多角形(xing)

傳代(dai)特性(xing) 可傳5代(dai)左(zuo)右(you)；3代以內狀(zhuang)態

消(xiao)化液 0.25%yi蛋白酶

培(pei)養(yang)條件 氣(qi)相(xiang)：空氣(qi)，95%；CO2，5%

兔骺(hou)軟(ruan)骨分離自骨骺(hou)生長板；骨骺(hou)生長板位於長骨兩端骨骺(hou)和骨幹(gan)之間(jian)的軟(ruan)骨組織，其(qi)中(zhong)的骺(hou)軟(ruan)骨細胞可分裂(lie)、成(cheng)熟(shu)、肥(fei)大，最終被(bei)骨組織所(suo)替換(huan)，對(dui)於長骨生長具有(you)重(zhong)要(yao)作(zuo)用。幼(you)稚(zhi)的骺(hou)軟(ruan)骨細胞位於軟(ruan)骨組織的表(biao)層，單個(ge)分(fen)布(bu)、體(ti)積較(jiao)小、呈橢(tuo)圓(yuan)形(xing)，長軸與(yu)軟(ruan)骨表面平行(xing)，越(yue)向(xiang)深(shen)層的骺(hou)軟(ruan)骨細胞體積之(zhi)間(jian)增(zeng)大呈(cheng)圓(yuan)形(xing)，細胞核圓(yuan)形(xing)或(huo)卵(luan)圓(yuan)形(xing)，染色(se)淺(qian)，細胞質弱(ruo)嗜堿性(xing)，常見數(shu)量(liang)不壹的脂滴(di)。成(cheng)熟(shu)的骺(hou)軟(ruan)骨細胞多2-8個(ge)成(cheng)群(qun)分(fen)布(bu)於軟(ruan)骨陷窩內，這些(xie)骺(hou)軟(ruan)骨細胞由同(tong)壹個(ge)母(mu)細胞分裂(lie)增(zeng)殖而成(cheng)，稱為(wei)同(tong)源細(xi)胞群(qun)。電(dian)鏡(jing)下，骺(hou)軟(ruan)骨細胞有突(tu)起和皺褶，細(xi)胞質內有(you)大量(liang)的粗面(mian)內質(zhi)網和發(fa)達(da)的高(gao)爾基(ji)復(fu)合體(ti)及少(shao)量(liang)的線(xian)粒(li)體(ti)。在組織切(qie)片中(zhong)，骺(hou)軟(ruan)骨細胞收(shou)縮為(wei)不規則形(xing)，在(zai)軟(ruan)骨囊和細(xi)胞之間(jian)出(chu)現(xian)較(jiao)大(da)的腔(qiang)隙(xi)。體(ti)外(wai)培(pei)養(yang)的骺(hou)軟(ruan)骨細胞對(dui)於研究其生(sheng)理(li)功能(neng)、藥(yao)物作用以及各(ge)種(zhong)致(zhi)病(bing)因(yin)素(su)作用下的病(bing)理(li)生理(li)改變(bian)具(ju)重(zhong)要(yao)意(yi)義(yi)。
方(fang)法簡(jian)介：

公司(si)實驗(yan)室分(fen)離(li)的兔骺(hou)軟(ruan)骨采(cai)用膠(jiao)原(yuan)酶-中(zhong)性(xing)dan白酶聯合消(xiao)化並(bing)軟(ruan)骨細胞專用培(pei)養(yang)基培(pei)養(yang)篩選制(zhi)備(bei)而來(lai)，細胞總量(liang)約(yue)為(wei)5×10?cells/瓶(ping)。
質(zhi)量(liang)檢(jian)測(ce)：

公司(si)實驗(yan)室分(fen)離(li)的兔骺(hou)軟(ruan)骨經(jing)Ⅱ型(xing)膠(jiao)原(yuan)蛋白(bai)免疫熒(ying)光鑒定(ding)，純度可達90%以上(shang)，且(qie)不含(han)有(you)HIV-1、HBV、HCV、支(zhi)原(yuan)體(ti)、細(xi)菌、酵母(mu)和(he)真菌等(deng)。

壹、細胞培(pei)養(yang)

1取材(cai) 在(zai)無菌環境(jing)下從(cong)機(ji)體(ti)取出某種(zhong)組織細(xi)胞（視(shi)實(shi)驗(yan)目的而(er)定(ding)），經(jing)過(guo)壹定的處(chu)理(li)（如(ru)消(xiao)化分(fen)散(san)細胞、分離(li)等(deng)）後接入(ru)培(pei)養(yang)器血中(zhong)，這壹過(guo)程稱為(wei)取(qu)材(cai)。如是(shi)細胞株的擴(kuo)大(da)培(pei)養(yang)則無取(qu)材(cai)這壹過(guo)程。機(ji)體(ti)取出的組織細(xi)胞的培(pei)養(yang)稱為(wei)原(yuan)代(dai)培(pei)養(yang)。2培(pei)養(yang) 將(jiang)取(qu)得的組織細(xi)胞接入(ru)培(pei)養(yang)瓶(ping)或(huo)培(pei)養(yang)板中(zhong)的過(guo)程稱為(wei)培(pei)養(yang)。3凍存及復(fu)蘇（可參閱後面有(you)關章(zhang)節(jie)）為(wei)了保(bao)存細(xi)胞，特別(bie)是(shi)不易獲(huo)得(de)的突(tu)變(bian)型(xing)細(xi)胞或(huo)細胞株，要(yao)將(jiang)細(xi)胞凍存。凍(dong)存的溫(wen)度壹般用液氮的溫(wen)度－196℃，將(jiang)細(xi)胞收(shou)集(ji)至(zhi)凍(dong)存管(guan)中(zhong)加入(ru)含(han)保(bao)護(hu)劑(ji)（壹般為(wei)二(er)甲(jia)亞碸或(huo)甘油(you)）的培(pei)養(yang)基，以壹定的冷卻(que)速(su)度凍存，最(zui)終保(bao)存於液氮中(zhong)。在(zai)極(ji)低(di)的溫(wen)度下，細(xi)胞保(bao)存的時(shi)間(jian)幾(ji)乎(hu)是(shi)無限(xian)的。復(fu)蘇壹般采(cai)用快(kuai)融方(fang)法，即(ji)從液氮中(zhong)取(qu)出(chu)凍(dong)存管(guan)後，立即(ji)放入(ru)37℃水(shui)中(zhong)，使(shi)之(zhi)在(zai)壹分鐘(zhong)內迅(xun)速(su)融解。然後將(jiang)細(xi)胞轉入(ru)培(pei)養(yang)器皿中(zhong)進行(xing)培(pei)養(yang)。

二(er)、原(yuan)代(dai)細胞分離(li)

凡(fan)是(shi)來源於胚胎(tai)、組織器(qi)官及外(wai)周血，經(jing)特(te)殊(shu)分離(li)方法制(zhi)備而來的原(yuan)初(chu)培(pei)養(yang)的細(xi)胞稱之(zhi)為(wei)原(yuan)代(dai)細胞。1懸浮(fu)細胞的分(fen)離(li)方(fang)法組織材(cai)料若(ruo)來自血液、羊水(shui)、胸水(shui)或(huo)腹(fu)水(shui)的懸液材料(liao)，的方(fang)法是(shi)采(cai)用1000r/min的低(di)速(su)離(li)心(xin)10分鐘(zhong)。經(jing)離(li)心(xin)後由於各(ge)種(zhong)細(xi)胞的比重不同(tong)可在分(fen)層液中(zhong)形(xing)成(cheng)不同(tong)層，這樣(yang)可根據需要(yao)收(shou)獲目的細(xi)胞。2實體(ti)組織材(cai)料的分(fen)離(li)方(fang)法對(dui)於實體(ti)組織材(cai)料，由於細胞間(jian)結(jie)合(he)緊(jin)密(mi)，為(wei)了使組織中(zhong)的細(xi)胞充分分散(san)，形成(cheng)細胞懸液，可采(cai)用機(ji)械分散(san)法（物(wu)理裂解）和消(xiao)化分(fen)離(li)法。

三(san)、細(xi)胞增(zeng)殖檢測技(ji)術

目前主(zhu)要(yao)有(you)兩(liang)種(zhong)用於檢測(ce)細(xi)胞增(zeng)殖能力的方(fang)法。壹種(zhong)是(shi)直接的方(fang)法，通(tong)過(guo)直接測定(ding)進行(xing)分裂(lie)

的細(xi)胞數(shu)來評價(jia)細胞的增(zeng)殖能力。另壹種(zhong)是(shi)間(jian)接的方(fang)法，即(ji)細胞活力（cell viability）檢測(ce)方法，通(tong)過(guo)檢測(ce)樣(yang)品中(zhong)健(jian)康細(xi)胞的數(shu)目來評價(jia)細胞的增(zeng)殖能力。顯然，細胞活力檢測(ce)法並(bing)不能最(zui)終證明(ming)檢(jian)測樣(yang)品中(zhong)的細(xi)胞是(shi)否在(zai)增(zeng)殖。如細胞在某壹培(pei)養(yang)條件下會(hui)自發啟動雕(diao)亡程序，但藥物的幹(gan)擾(rao)可抑(yi)制(zhi)雕(diao)亡的發(fa)生(sheng)；這時(shi)若(ruo)采(cai)用細(xi)胞活力檢測(ce)法，顯然可以區(qu)分(fen)兩種(zhong)條(tiao)件下的細(xi)胞數(shu)量(liang)，但我們並不能從(cong)藥物(wu)幹(gan)擾(rao)組細(xi)胞數(shu)大於對(dui)照組的事(shi)實說(shuo)明(ming)藥(yao)物可促進細胞增(zeng)殖的結(jie)論(lun)。所以最(zui)直接的證據應該(gai)采(cai)用方(fang)法壹。

取材(cai)：首先，用培(pei)養(yang)液濕潤(run)所取的組織材(cai)料，並(bing)用鋒(feng)利(li)的眼(yan)科(ke)剪(jian)去(qu)除(chu)附(fu)在其(qi)上(shang)的脂肪(fang)和(he)結締(di)組織。接著用平(ping)衡液（如PBS或(huo)Hanks液）漂(piao)洗(xi)，再用眼(yan)科(ke)彎剪(jian)將(jiang)組織塊(kuai)剪成(cheng)小塊。多次用PBS或(huo)Hanks液漂(piao)洗(xi)，直到液體清亮(liang)、無油(you)滴(di)為(wei)止(zhi)。

接種(zhong)：用濕(shi)潤(run)的吸(xi)管(guan)吸(xi)取切(qie)碎(sui)的組織塊(kuai)，輕輕(qing)吹(chui)到(dao)培(pei)養(yang)瓶(ping)皿中(zhong)，並(bing)按壹定間(jian)距均(jun)勻放在(zai)培(pei)養(yang)瓶(ping)底(di)壁上(shang)。註意(yi)不要(yao)過(guo)多，確保(bao)組織塊(kuai)切面(mian)貼(tie)在(zai)培(pei)養(yang)瓶(ping)底(di)壁上(shang)。

培(pei)養(yang)：將(jiang)培(pei)養(yang)瓶(ping)翻轉，使瓶(ping)底(di)朝上，在(zai)種(zhong)植(zhi)了組織塊(kuai)壹側(ce)的對(dui)側(ce)面(mian)加足(zu)培(pei)養(yang)液，避免組織塊(kuai)與培(pei)養(yang)液接觸，然後塞緊(jin)瓶(ping)塞(sai)。將(jiang)種(zhong)植(zhi)了組織塊(kuai)的壹側(ce)朝上，靜(jing)置於37℃培(pei)養(yang)箱(xiang)中(zhong)。待(dai)組織塊(kuai)貼(tie)壁1到(dao)3小時後翻瓶(ping)，使(shi)貼(tie)壁的組織塊(kuai)浸(jin)沒(mei)在(zai)培(pei)養(yang)液中(zhong)，繼(ji)續(xu)靜(jing)置。換(huan)液：每隔2到3天更(geng)換(huan)壹次培(pei)養(yang)液，或(huo)者根據培(pei)養(yang)瓶(ping)種(zhong)顏(yan)色(se)的變(bian)化確(que)定(ding)換(huan)液時間(jian)。

壹、原代(dai)細(xi)胞計(ji)數(shu)

將(jiang)血球計(ji)數(shu)板及蓋片用擦(ca)試幹(gan)凈，並(bing)將(jiang)蓋片蓋在計(ji)數(shu)板上。

將(jiang)細(xi)胞懸液吸出(chu)少(shao)許，滴(di)加在蓋片邊緣(yuan)，使懸液充滿蓋片和(he)計(ji)數(shu)板之間(jian)。

靜(jing)置3分鐘(zhong)。

鏡下觀(guan)察，計(ji)算計(ji)數(shu)板四(si)大格(ge)細(xi)胞總數(shu)，壓線細胞只計(ji)左(zuo)側(ce)和(he)上(shang)方(fang)的。然後按下式計(ji)算：

細(xi)胞數(shu)/ml＝4大格細胞總數(shu)/ 4×10000

註意(yi)：鏡(jing)下偶見由兩(liang)個(ge)以上(shang)細(xi)胞組成(cheng)的細(xi)胞團，應(ying)按單個(ge)細(xi)胞計(ji)算，若(ruo)細(xi)胞團占(zhan)10%以上(shang)，說(shuo)明(ming)分(fen)散(san)不好，需(xu)重新(xin)制備細胞懸液。

二(er)、原(yuan)代(dai)細胞活力

將(jiang)細(xi)胞懸液以0.5ml加入(ru)試(shi)管(guan)中(zhong)。

加入(ru)0.5ml 0.4%臺盼(pan)蘭(lan)染液，染色(se)2壹3分鐘(zhong)。

吸取少(shao)許懸液塗(tu)於載玻(bo)片上(shang)，加上蓋片。

鏡下取(qu)幾(ji)個(ge)任(ren)意(yi)視(shi)野分別計(ji)死(si)細胞和活(huo)細胞數(shu)，計(ji)細胞活力。

死(si)細胞能被(bei)臺盼(pan)蘭(lan)染上(shang)色(se)，鏡(jing)下可見深蘭(lan)色(se)的細(xi)胞，活細(xi)胞不被染色(se)，鏡(jing)下呈(cheng)無色(se)透(tou)明(ming)狀(zhuang)。

活(huo)力測定(ding)可以和(he)細(xi)胞計(ji)數(shu)合起來進行(xing)，但要(yao)考(kao)慮到(dao)染液對(dui)原細(xi)胞懸液的加倍稀(xi)釋作用。