【概(gai)要描述(shu)】兔(tu)肺微血管內皮(pi)細胞的相(xiang)關(guan)產品：A549/LUC (STR)人肺癌(ai)細(xi)胞小(xiao)鼠(shu)原(yuan)代(dai)肝內膽管上皮(pi)細胞人原代(dai)淋巴結成(cheng)纖維(wei)細胞兔(tu)原代頸動脈(mai)成(cheng)纖維(wei)細胞兔(tu)原代心(xin)肌(ji)成(cheng)纖維(wei)細胞兔(tu)原代角膜基(ji)質細胞小(xiao)鼠(shu)原(yuan)代(dai)T淋巴細(xi)胞小(xiao)鼠(shu)原(yuan)代(dai)眼微血管內皮(pi)細胞小(xiao)鼠(shu)原(yuan)代(dai)脂肪血管基(ji)質細胞兔(tu)原代腸(chang)神(shen)經膠質細胞

兔(tu)肺微血管內皮(pi)細胞

包被(bei)條(tiao)件(jian) PLL（0.1mg/ml），明膠（0.1%）

培(pei)養基(ji) 含(han)FBS、生長(chang)添(tian)加劑(ji)、Penicillin、Streptomycin等(deng)

換(huan)液頻(pin)率(lv) 每(mei)2-3天(tian)換(huan)液壹次

生長(chang)特性(xing) 貼壁(bi)

細(xi)胞形(xing)態(tai) 內皮(pi)細胞樣(yang)

傳(chuan)代(dai)特性(xing) 可(ke)傳(chuan)2-3代(dai)

消(xiao)化(hua)液 0.25%yi蛋(dan)白(bai)酶(mei)

培(pei)養條(tiao)件(jian) 氣(qi)相(xiang)：空(kong)氣(qi)，95%；CO2，5%

兔(tu)肺微血管內皮(pi)分離自(zi)肺組(zu)織；肺是(shi)機體的呼吸(xi)器(qi)官(guan)，位(wei)於(yu)胸腔(qiang)，左右各壹，覆(fu)蓋於(yu)心(xin)之上(shang)。肺有(you)分葉(ye)，左二(er)右三，共(gong)五葉(ye)。肺經(jing)肺系(xi)（指氣管、支氣管等(deng)）與喉、鼻相(xiang)連，故稱喉為肺之(zhi)門(men)戶(hu)，鼻為肺之(zhi)外(wai)竅(qiao)。微血管內皮(pi)細胞密(mi)切(qie)參與包括(kuo)再(zai)生、發育(yu)、傷(shang)口(kou)愈(yu)合等(deng)壹系(xi)列生理(li)及炎(yan)癥反(fan)應(ying)。細(xi)胞呈梭(suo)形(xing)或(huo)多角形(xing)，形(xing)成(cheng)單(dan)層(ceng)後(hou)呈鵝(e)卵石(shi)樣或鋪路石(shi)樣排列。肺微血管內皮(pi)細胞構成(cheng)半(ban)選擇性(xing)屏障，該屏障對於(yu)肺氣(qi)體交換(huan)，調節(jie)液體和可(ke)溶物在血液與肺間(jian)質之間(jian)的流(liu)動(dong)具(ju)有(you)重(zhong)要意義(yi)。
方(fang)法(fa)簡(jian)介(jie)：

公(gong)司實驗室(shi)分離的兔肺微血管內皮(pi)采用(yong)組織貼塊(kuai)法並(bing)結合內皮(pi)細胞專(zhuan)用培(pei)養基(ji)培(pei)養篩選制備而(er)來(lai)，細胞總(zong)量約為5×10?cells/瓶(ping)。
質量檢測(ce)：

公(gong)司實驗室(shi)分離的兔肺微血管內皮(pi)經CD31免(mian)疫(yi)熒(ying)光(guang)鑒定(ding)，純(chun)度可達90%以上(shang)，且(qie)不含(han)有HIV-1、HBV、HCV、支(zhi)原體、細(xi)菌(jun)、酵母和真(zhen)菌(jun)等(deng)。

壹、細胞培(pei)養

1取(qu)材(cai) 在無菌(jun)環境下從(cong)機體取(qu)出某(mou)種組織細(xi)胞（視(shi)實驗目(mu)的而(er)定(ding)），經(jing)過(guo)壹定的處理（如消化分散(san)細胞、分離等(deng)）後(hou)接(jie)入培(pei)養器(qi)血中，這(zhe)壹過程稱為取材(cai)。如(ru)是(shi)細(xi)胞株(zhu)的擴大(da)培(pei)養則無取(qu)材(cai)這(zhe)壹過程。機(ji)體取(qu)出的組織細(xi)胞的培(pei)養稱為原代培(pei)養。2培(pei)養 將取(qu)得(de)的組織細(xi)胞接(jie)入培(pei)養瓶(ping)或培(pei)養板中(zhong)的過程稱為培(pei)養。3凍存及復蘇(su)（可參閱後(hou)面有關(guan)章節(jie)）為了保(bao)存細(xi)胞，特(te)別是不易獲得(de)的突變型細胞或(huo)細胞株(zhu)，要(yao)將(jiang)細(xi)胞凍存。凍存的溫度壹般(ban)用液氮(dan)的溫度－196℃，將細(xi)胞收(shou)集至凍存管中加入含(han)保(bao)護劑(ji)（壹般(ban)為二(er)甲亞碸或(huo)甘油(you)）的培(pei)養基(ji)，以(yi)壹定的冷(leng)卻(que)速(su)度凍存，最(zui)終保(bao)存於(yu)液氮(dan)中。在極(ji)低的溫度下，細(xi)胞保(bao)存的時間(jian)幾乎是(shi)無限的。復蘇(su)壹般(ban)采用(yong)快(kuai)融(rong)方(fang)法(fa)，即從(cong)液氮(dan)中取(qu)出凍存管後(hou)，立(li)即放(fang)入37℃水中，使(shi)之在壹分鐘內迅速(su)融(rong)解(jie)。然後(hou)將(jiang)細胞轉(zhuan)入培(pei)養器(qi)皿(min)中進行(xing)培(pei)養。

二(er)、原代細胞分離

凡(fan)是(shi)來(lai)源於(yu)胚胎(tai)、組(zu)織器(qi)官(guan)及外(wai)周血，經特(te)殊(shu)分離方(fang)法(fa)制備而(er)來(lai)的原初(chu)培(pei)養的細胞稱之(zhi)為原代細(xi)胞。1懸(xuan)浮(fu)細胞的分離方(fang)法(fa)組(zu)織材(cai)料(liao)若來(lai)自血液、羊水、胸水或腹(fu)水的懸液材(cai)料(liao)，的方(fang)法(fa)是(shi)采(cai)用1000r/min的低速(su)離(li)心(xin)10分鐘。經(jing)離心(xin)後(hou)由於(yu)各(ge)種細(xi)胞的比重(zhong)不同可(ke)在分層(ceng)液中(zhong)形(xing)成(cheng)不同層(ceng)，這(zhe)樣可(ke)根(gen)據需要收(shou)獲目(mu)的細胞。2實體組(zu)織材(cai)料(liao)的分離方(fang)法(fa)對(dui)於(yu)實體組(zu)織材(cai)料(liao)，由於(yu)細(xi)胞間(jian)結合緊(jin)密(mi)，為了使(shi)組織中(zhong)的細胞充分分散(san)，形(xing)成(cheng)細胞懸(xuan)液，可(ke)采(cai)用(yong)機(ji)械(xie)分散(san)法（物(wu)理裂(lie)解）和消(xiao)化分離法(fa)。

三(san)、細(xi)胞增(zeng)殖檢測(ce)技術(shu)

目(mu)前主(zhu)要(yao)有(you)兩(liang)種(zhong)用於(yu)檢(jian)測細(xi)胞增(zeng)殖能力(li)的方(fang)法(fa)。壹種是(shi)直(zhi)接(jie)的方(fang)法(fa)，通過(guo)直(zhi)接(jie)測(ce)定進行(xing)分裂

的細胞數來(lai)評價細(xi)胞的增殖(zhi)能(neng)力(li)。另(ling)壹種是(shi)間(jian)接的方(fang)法(fa)，即細(xi)胞活力(li)（cell viability）檢測方(fang)法(fa)，通過(guo)檢(jian)測樣品(pin)中(zhong)健(jian)康細(xi)胞的數目(mu)來(lai)評價細(xi)胞的增殖(zhi)能(neng)力(li)。顯然，細胞活力(li)檢測法並不能最(zui)終(zhong)證(zheng)明檢測樣(yang)品中(zhong)的細胞是(shi)否在增殖(zhi)。如細(xi)胞在某(mou)壹培(pei)養條(tiao)件(jian)下會(hui)自發啟動(dong)雕(diao)亡程序，但(dan)藥(yao)物的幹擾(rao)可(ke)抑制雕(diao)亡的發生；這(zhe)時若采用(yong)細胞活力(li)檢測法，顯然可以區(qu)分兩種(zhong)條(tiao)件(jian)下的細胞數量，但(dan)我們(men)並不能從(cong)藥(yao)物幹(gan)擾組(zu)細(xi)胞數大(da)於(yu)對(dui)照(zhao)組(zu)的事(shi)實說(shuo)明藥(yao)物可(ke)促進細(xi)胞增(zeng)殖的結論。所以最(zui)直(zhi)接(jie)的證(zheng)據應(ying)該采用方(fang)法(fa)壹。

取(qu)材(cai)：首(shou)先，用培(pei)養液濕(shi)潤(run)所取的組織材(cai)料(liao)，並(bing)用鋒(feng)利的眼科剪去除(chu)附(fu)在其上(shang)的脂肪和結締組織。接(jie)著用(yong)平衡液（如(ru)PBS或(huo)Hanks液）漂(piao)洗，再(zai)用(yong)眼科彎剪將組(zu)織塊(kuai)剪成(cheng)小塊(kuai)。多次用(yong)PBS或(huo)Hanks液漂(piao)洗，直(zhi)到(dao)液體清(qing)亮、無油(you)滴(di)為止(zhi)。

接(jie)種(zhong)：用濕(shi)潤(run)的吸管吸取切(qie)碎的組織塊(kuai)，輕輕(qing)吹(chui)到(dao)培(pei)養瓶(ping)皿中(zhong)，並(bing)按(an)壹定間(jian)距均(jun)勻(yun)放(fang)在培(pei)養瓶(ping)底壁(bi)上(shang)。註(zhu)意不要過(guo)多，確保(bao)組(zu)織塊(kuai)切(qie)面貼在培(pei)養瓶(ping)底壁(bi)上(shang)。

培(pei)養：將培(pei)養瓶(ping)翻轉(zhuan)，使(shi)瓶(ping)底朝上，在種植(zhi)了組(zu)織塊(kuai)壹側的對側面加足培(pei)養液，避(bi)免(mian)組(zu)織塊(kuai)與培(pei)養液接(jie)觸(chu)，然後(hou)塞(sai)緊(jin)瓶(ping)塞(sai)。將(jiang)種(zhong)植(zhi)了組(zu)織塊(kuai)的壹側朝上，靜(jing)置(zhi)於(yu)37℃培(pei)養箱(xiang)中(zhong)。待(dai)組織塊(kuai)貼壁(bi)1到(dao)3小時後(hou)翻(fan)瓶(ping)，使(shi)貼壁(bi)的組織塊(kuai)浸沒(mei)在培(pei)養液中(zhong)，繼(ji)續(xu)靜(jing)置(zhi)。換(huan)液：每(mei)隔(ge)2到(dao)3天(tian)更換(huan)壹次培(pei)養液，或(huo)者(zhe)根(gen)據培(pei)養瓶(ping)種顏(yan)色的變化(hua)確定(ding)換(huan)液時間(jian)。

壹、原代(dai)細(xi)胞計(ji)數

將(jiang)血球計(ji)數板(ban)及蓋片(pian)用(yong)擦試幹凈(jing)，並將蓋(gai)片(pian)蓋(gai)在計(ji)數板(ban)上。

將(jiang)細(xi)胞懸(xuan)液吸(xi)出少許，滴(di)加在蓋片(pian)邊緣(yuan)，使(shi)懸液充滿蓋(gai)片(pian)和計(ji)數板(ban)之間(jian)。

靜(jing)置(zhi)3分鐘。

鏡下觀察(cha)，計(ji)算(suan)計(ji)數板(ban)四(si)大(da)格細(xi)胞總(zong)數，壓(ya)線細胞只(zhi)計(ji)左側和上(shang)方(fang)的。然後(hou)按(an)下式(shi)計(ji)算(suan)：

細(xi)胞數/ml＝4大(da)格細(xi)胞總(zong)數/ 4×10000

註(zhu)意(yi)：鏡下偶見(jian)由兩(liang)個(ge)以上細胞組(zu)成(cheng)的細胞團，應(ying)按(an)單(dan)個(ge)細胞計(ji)算(suan)，若細胞團占10%以(yi)上(shang)，說明分散(san)不好，需重新(xin)制備細(xi)胞懸(xuan)液。

二(er)、原代細胞活力(li)

將(jiang)細(xi)胞懸(xuan)液以(yi)0.5ml加入試管中。

加入0.5ml 0.4%臺(tai)盼蘭(lan)染(ran)液，染(ran)色(se)2壹3分鐘。

吸(xi)取(qu)少許懸液塗(tu)於(yu)載(zai)玻片(pian)上(shang)，加上蓋(gai)片(pian)。

鏡下取(qu)幾個(ge)任意視(shi)野分別計(ji)死(si)細(xi)胞和活細(xi)胞數，計(ji)細胞活力(li)。

死(si)細(xi)胞能(neng)被臺(tai)盼蘭(lan)染(ran)上色(se)，鏡下可(ke)見(jian)深(shen)蘭色(se)的細胞，活細(xi)胞不被染(ran)色(se)，鏡下呈無色(se)透明狀。

活力(li)測定可以和細(xi)胞計(ji)數合起(qi)來(lai)進行(xing)，但(dan)要考慮(lv)到染液對(dui)原(yuan)細(xi)胞懸(xuan)液的加倍稀(xi)釋作(zuo)用(yong)。