【概(gai)要描(miao)述】兔(tu)肌(ji)腱(jian)幹細胞的相(xiang)關產品(pin)：HMC-1人肥大(da)細胞牛原代骨(gu)髓(sui)間(jian)充質幹細胞小鼠(shu)原代口(kou)腔黏(nian)膜成纖維細胞人(ren)原代腦血(xue)管(guan)周細胞大(da)鼠(shu)原代前脂肪細胞人(ren)主(zhu)動脈瓣(ban)膜內(nei)皮(pi)細胞兔(tu)原代子(zi)宮微血(xue)管(guan)內(nei)皮(pi)細胞人(ren)原代腎(shen)動脈內(nei)皮(pi)細胞大(da)鼠(shu)原代三(san)叉(cha)神經(jing)星形膠質細胞人(ren)原代腎(shen)小管上皮(pi)細胞

兔(tu)肌(ji)腱(jian)幹細胞

培(pei)養基 含(han)FBS、生長(chang)添加(jia)劑(ji)、Penicillin、Streptomycin等

換(huan)液(ye)頻(pin)率(lv) 每(mei)2-3天換(huan)液(ye)壹(yi)次

生長(chang)特性 貼(tie)壁(bi)

細胞形態(tai) 成纖維細胞樣(yang)

傳(chuan)代特性 可(ke)傳(chuan)5代左(zuo)右；3代以內(nei)狀態

消(xiao)化液 0.25%yi蛋(dan)白酶

培(pei)養條(tiao)件(jian) 氣(qi)相(xiang)：空(kong)氣(qi)，95%；CO2，5%

兔(tu)肌(ji)腱(jian)幹分離(li)自(zi)肌腱(jian)組(zu)織(zhi)；肌(ji)腱(jian)是(shi)肌(ji)腹兩(liang)端的索狀或(huo)膜狀致密(mi)結(jie)締(di)組(zu)織(zhi)，便於(yu)肌(ji)肉附(fu)著和固定(ding)。壹(yi)塊(kuai)肌(ji)肉(rou)的肌腱(jian)分附(fu)在(zai)兩(liang)塊或(huo)兩(liang)塊以上的不同(tong)骨上，是(shi)由(you)於肌腱(jian)的牽(qian)引作用(yong)才能(neng)使肌(ji)肉(rou)的收(shou)縮帶(dai)動不同(tong)骨的運動。每壹(yi)塊(kuai)骨(gu)骼肌都分成肌(ji)腹和肌腱(jian)兩(liang)部(bu)分，肌(ji)腹由肌(ji)纖維構(gou)成，色(se)紅質軟(ruan)，有(you)收(shou)縮能(neng)力(li)，肌(ji)腱(jian)由致密(mi)結(jie)締(di)組(zu)織(zhi)構(gou)成，色(se)乳白(bai)較(jiao)硬，沒(mei)有(you)收(shou)縮能(neng)力(li)。肌(ji)腱(jian)把骨骼肌附(fu)著於骨(gu)骼。長(chang)肌(ji)的肌腱(jian)多呈圓索狀，闊肌(ji)的肌腱(jian)闊而薄(bo)，呈膜狀，又叫腱(jian)膜。此處(chu)的肌腹即為(wei)通常所說(shuo)的紅肌，而肌腱(jian)即為(wei)白(bai)肌(ji)，分別控(kong)制肌(ji)肉的力量、爆發(fa)力和耐力(li)。肌(ji)腱(jian)幹細胞（TSCs）是(shi)壹(yi)種來(lai)源(yuan)於肌(ji)腱(jian)組(zu)織(zhi)的間(jian)充質幹細胞，其(qi)具(ju)有(you)多(duo)向(xiang)分化潛能(neng)，並且在外(wai)源(yuan)性(xing)前列腺素(su)E2作(zuo)用(yong)下異常分化。體外(wai)培(pei)養時(shi)該(gai)細胞群(qun)具(ju)有(you)克(ke)隆形成能(neng)力(li)、自(zi)我(wo)更(geng)新(xin)及(ji)多(duo)向分化潛能(neng)等(deng)幹(gan)細胞的普遍(bian)特性。肌(ji)腱(jian)幹細胞可(ke)以被(bei)誘(you)導(dao)向脂肪細胞、軟(ruan)骨樣(yang)細胞、骨(gu)細胞分化；在裸(luo)鼠(shu)模(mo)型(xing)中(zhong)，肌(ji)腱(jian)幹細胞還(hai)可(ke)以形成肌(ji)腱(jian)樣組(zu)織(zhi)，軟(ruan)骨樣(yang)組(zu)織(zhi)以及(ji)腱(jian)-骨連接(jie)樣組(zu)織(zhi)等(deng)。相(xiang)比骨髓(sui)間(jian)充質幹細胞而言(yan)，TSCs具(ju)有(you)更(geng)好的克(ke)隆形成能(neng)力(li)和增殖能(neng)力(li)，軟(ruan)骨相(xiang)關基因和肌腱(jian)相(xiang)關基因表達(da)更(geng)高(gao)，具(ju)有(you)更(geng)好的成骨(gu)、成脂和成軟(ruan)骨能(neng)力(li)，因(yin)此可(ke)以作為(wei)組(zu)織(zhi)工程中(zhong)的種子(zi)細胞。
方(fang)法(fa)簡介：

公司實驗室(shi)分離(li)的兔(tu)肌(ji)腱(jian)幹采(cai)用(yong)膠原酶、中性(xing)dan白(bai)酶混(hun)合(he)消(xiao)化法(fa)並通過肌腱(jian)幹細胞專(zhuan)用(yong)培養基培養篩選制備(bei)而來，細胞總量約為(wei)5×10?cells/瓶。
質量檢測(ce)：

公司實驗室(shi)分離(li)的兔(tu)肌(ji)腱(jian)幹經(jing)CD44免疫(yi)熒(ying)光鑒定(ding)，純度可(ke)達(da)90%以上，且不含(han)有(you)HIV-1、HBV、HCV、支(zhi)原體(ti)、細菌(jun)、酵母和真(zhen)菌(jun)等。

壹(yi)、細胞培(pei)養

1取(qu)材 在無(wu)菌(jun)環境下從(cong)機體取(qu)出某種組(zu)織(zhi)細胞（視實驗目的而定(ding)），經(jing)過壹定(ding)的處(chu)理（如(ru)消(xiao)化分散(san)細胞、分離(li)等）後(hou)接(jie)入培養器血(xue)中(zhong)，這壹過程稱(cheng)為(wei)取(qu)材。如(ru)是(shi)細胞株(zhu)的擴(kuo)大培養則無(wu)取(qu)材這壹過程。機體取(qu)出的組(zu)織(zhi)細胞的培養稱(cheng)為(wei)原代培(pei)養。2培養 將取(qu)得的組(zu)織(zhi)細胞接(jie)入培養瓶或(huo)培養板(ban)中的過程稱(cheng)為(wei)培(pei)養。3凍(dong)存及(ji)復(fu)蘇（可(ke)參(can)閱後(hou)面(mian)有(you)關(guan)章節）為(wei)了保存細胞，特別是(shi)不易獲得的突變(bian)型細胞或(huo)細胞株(zhu)，要將細胞凍(dong)存。凍(dong)存的溫度壹般用(yong)液氮的溫度－196℃，將細胞收(shou)集至(zhi)凍(dong)存管(guan)中(zhong)加(jia)入含(han)保護劑(ji)（壹般(ban)為(wei)二(er)甲亞碸(feng)或(huo)甘油(you)）的培養基，以壹定(ding)的冷卻速(su)度凍(dong)存，最(zui)終(zhong)保存於(yu)液氮(dan)中(zhong)。在(zai)極(ji)低的溫度下，細胞保存的時(shi)間(jian)幾(ji)乎是(shi)無(wu)限的。復(fu)蘇壹(yi)般采(cai)用(yong)快融方(fang)法(fa)，即從(cong)液氮(dan)中取(qu)出凍(dong)存管(guan)後(hou)，立即放入37℃水(shui)中，使之(zhi)在(zai)壹分鐘(zhong)內(nei)迅(xun)速(su)融解(jie)。然後(hou)將細胞轉入培養器皿中進(jin)行培(pei)養。

二(er)、原代細胞分離(li)

凡(fan)是(shi)來(lai)源於胚(pei)胎(tai)、組(zu)織(zhi)器(qi)官及(ji)外(wai)周(zhou)血(xue)，經(jing)特殊分離(li)方(fang)法(fa)制備(bei)而來的原初(chu)培(pei)養的細胞稱(cheng)之為(wei)原代細胞。1懸(xuan)浮(fu)細胞的分離(li)方(fang)法(fa)組(zu)織(zhi)材料(liao)若(ruo)來自(zi)血(xue)液(ye)、羊水(shui)、胸水(shui)或(huo)腹水(shui)的懸液(ye)材料(liao)，的方(fang)法(fa)是(shi)采(cai)用(yong)1000r/min的低速(su)離(li)心(xin)10分鐘(zhong)。經(jing)離(li)心(xin)後(hou)由(you)於各(ge)種細胞的比重(zhong)不同(tong)可(ke)在(zai)分層液(ye)中(zhong)形成不同(tong)層，這樣可(ke)根據(ju)需(xu)要收(shou)獲目的細胞。2實(shi)體(ti)組(zu)織(zhi)材料(liao)的分離(li)方(fang)法(fa)對(dui)於(yu)實體(ti)組(zu)織(zhi)材料(liao)，由於(yu)細胞間(jian)結(jie)合(he)緊(jin)密(mi)，為(wei)了使組(zu)織(zhi)中(zhong)的細胞充(chong)分分散(san)，形成細胞懸(xuan)液(ye)，可(ke)采(cai)用(yong)機械(xie)分散(san)法(fa)（物(wu)理裂(lie)解(jie)）和消(xiao)化分離(li)法(fa)。

三(san)、細胞增殖檢(jian)測(ce)技術

目前主要有(you)兩(liang)種用(yong)於檢測(ce)細胞增殖能(neng)力(li)的方(fang)法(fa)。壹種是(shi)直(zhi)接的方(fang)法(fa)，通過直接(jie)測(ce)定(ding)進(jin)行(xing)分裂(lie)

的細胞數(shu)來(lai)評價細胞的增殖能(neng)力(li)。另壹種是(shi)間(jian)接的方(fang)法(fa)，即細胞活(huo)力（cell viability）檢測(ce)方(fang)法(fa)，通過檢測(ce)樣(yang)品(pin)中健(jian)康細胞的數(shu)目來(lai)評價細胞的增殖能(neng)力(li)。顯(xian)然，細胞活(huo)力檢測(ce)法(fa)並不能(neng)最(zui)終(zhong)證(zheng)明(ming)檢(jian)測(ce)樣(yang)品(pin)中的細胞是(shi)否(fou)在增殖。如(ru)細胞在(zai)某壹培養條(tiao)件(jian)下(xia)會(hui)自(zi)發(fa)啟動雕亡(wang)程序(xu)，但(dan)藥物(wu)的幹擾(rao)可(ke)抑(yi)制雕(diao)亡的發(fa)生；這時(shi)若(ruo)采(cai)用(yong)細胞活(huo)力檢測(ce)法(fa)，顯然可(ke)以區分兩(liang)種條(tiao)件(jian)下(xia)的細胞數(shu)量，但我(wo)們(men)並不能(neng)從(cong)藥物(wu)幹擾(rao)組(zu)細胞數(shu)大(da)於(yu)對(dui)照組(zu)的事(shi)實(shi)說(shuo)明(ming)藥物(wu)可(ke)促(cu)進(jin)細胞增殖的結(jie)論(lun)。所(suo)以最(zui)直接(jie)的證據(ju)應(ying)該(gai)采(cai)用(yong)方(fang)法(fa)壹。

取(qu)材：首先，用(yong)培養液濕潤所取(qu)的組(zu)織(zhi)材料(liao)，並用(yong)鋒利(li)的眼科(ke)剪去(qu)除(chu)附(fu)在(zai)其(qi)上的脂肪和結(jie)締(di)組(zu)織(zhi)。接(jie)著用(yong)平衡(heng)液(ye)（如(ru)PBS或(huo)Hanks液）漂(piao)洗(xi)，再用(yong)眼科(ke)彎剪(jian)將組(zu)織(zhi)塊(kuai)剪成小塊。多(duo)次用(yong)PBS或(huo)Hanks液漂(piao)洗(xi)，直(zhi)到液(ye)體清(qing)亮(liang)、無(wu)油(you)滴(di)為(wei)止。

接(jie)種：用(yong)濕潤的吸管(guan)吸取(qu)切(qie)碎(sui)的組(zu)織(zhi)塊(kuai)，輕輕(qing)吹到培(pei)養瓶皿中，並按壹(yi)定(ding)間(jian)距均(jun)勻(yun)放在(zai)培(pei)養瓶底(di)壁上。註(zhu)意(yi)不要過多，確(que)保組(zu)織(zhi)塊(kuai)切(qie)面(mian)貼(tie)在(zai)培養瓶底(di)壁上。

培(pei)養：將培養瓶翻轉，使瓶底(di)朝上，在種植了組(zu)織(zhi)塊(kuai)壹側的對(dui)側面(mian)加足(zu)培養液，避(bi)免組(zu)織(zhi)塊(kuai)與培(pei)養液接觸(chu)，然後(hou)塞緊瓶塞。將種植了組(zu)織(zhi)塊(kuai)的壹側朝上，靜置於37℃培(pei)養箱中(zhong)。待(dai)組(zu)織(zhi)塊(kuai)貼(tie)壁(bi)1到3小時(shi)後(hou)翻瓶，使貼(tie)壁(bi)的組(zu)織(zhi)塊(kuai)浸(jin)沒在(zai)培養液中，繼續(xu)靜(jing)置(zhi)。換(huan)液(ye)：每(mei)隔(ge)2到3天更(geng)換(huan)壹(yi)次培(pei)養液，或(huo)者根據(ju)培養瓶種顏色(se)的變化確定(ding)換(huan)液(ye)時(shi)間(jian)。

壹(yi)、原代細胞計(ji)數(shu)

將血(xue)球(qiu)計數(shu)板(ban)及(ji)蓋片用(yong)擦試幹凈，並將蓋片蓋在計(ji)數(shu)板(ban)上。

將細胞懸(xuan)液(ye)吸出少(shao)許(xu)，滴(di)加在(zai)蓋片邊(bian)緣(yuan)，使懸(xuan)液(ye)充滿(man)蓋片和計數(shu)板(ban)之間(jian)。

靜(jing)置(zhi)3分鐘(zhong)。

鏡下觀(guan)察(cha)，計(ji)算(suan)計數(shu)板(ban)四大(da)格(ge)細胞總數(shu)，壓(ya)線(xian)細胞只計左側和上方(fang)的。然後(hou)按(an)下式計(ji)算(suan)：

細胞數(shu)/ml＝4大(da)格(ge)細胞總數(shu)/ 4×10000

註(zhu)意(yi)：鏡下偶見由兩(liang)個以上細胞組(zu)成的細胞團(tuan)，應(ying)按單(dan)個細胞計(ji)算(suan)，若(ruo)細胞團(tuan)占10%以上，說(shuo)明(ming)分散(san)不好，需(xu)重新(xin)制備(bei)細胞懸(xuan)液(ye)。

二(er)、原代細胞活(huo)力

將細胞懸(xuan)液(ye)以0.5ml加入試管中。

加(jia)入0.5ml 0.4%臺盼(pan)蘭(lan)染(ran)液(ye)，染(ran)色(se)2壹(yi)3分鐘(zhong)。

吸(xi)取(qu)少(shao)許(xu)懸(xuan)液塗於載玻片上，加上蓋片。

鏡下取(qu)幾(ji)個任(ren)意(yi)視野(ye)分別計(ji)死(si)細胞和活(huo)細胞數(shu)，計(ji)細胞活(huo)力。

死(si)細胞能(neng)被(bei)臺盼(pan)蘭(lan)染(ran)上色，鏡下可(ke)見(jian)深(shen)蘭(lan)色的細胞，活(huo)細胞不被(bei)染(ran)色(se)，鏡下呈(cheng)無(wu)色透明狀。

活(huo)力測(ce)定(ding)可(ke)以和細胞計(ji)數(shu)合(he)起來進行(xing)，但(dan)要考慮(lv)到染(ran)液(ye)對(dui)原細胞懸(xuan)液(ye)的加倍(bei)稀釋(shi)作用(yong)。