【概(gai)要描述】人(ren)食(shi)管癌(ai)組織(zhi)源(yuan)成纖維細胞(bao)公(gong)司正在(zai)出(chu)售的產品：C6+LUC大(da)鼠(shu)膠(jiao)質瘤細胞(bao)小(xiao)鼠關(guan)節(jie)軟(ruan)骨(gu)細胞(bao)大(da)鼠關(guan)節(jie)軟(ruan)骨(gu)細胞(bao)人(ren)顱(lu)蓋造(zao)骨(gu)細胞(bao)人(ren)滑(hua)膜(mo)細(xi)胞(bao)小(xiao)鼠表皮角(jiao)質形(xing)成細胞(bao)大(da)鼠表皮角(jiao)質形(xing)成細胞(bao)人(ren)骨(gu)骼肌細(xi)胞(bao)小(xiao)鼠毛(mao)囊(nang)細(xi)胞(bao)大(da)鼠毛(mao)囊(nang)細(xi)胞(bao)

本(ben)公(gong)司所有產(chan)品僅(jin)供科學(xue)實驗(yan)，不做其他(ta)科學(xue)實驗(yan)外的(de)使(shi)用！

人(ren)食(shi)管癌(ai)組織(zhi)源(yuan)成纖維分離自(zi)食(shi)管癌(ai)組織(zhi)；食(shi)管癌(ai)是常(chang)見的消化(hua)道腫瘤(liu)，世界(jie)每(mei)年(nian)約(yue)有30萬人(ren)死(si)於(yu)食(shi)管癌(ai)。其發病率和(he)死亡(wang)率各國差異(yi)很(hen)大。我(wo)國是世界(jie)上(shang)食(shi)管癌(ai)高發地(di)區之壹(yi)，每(mei)年(nian)平(ping)均病死約(yue)15萬人(ren)。男多於(yu)女，發病年(nian)齡(ling)多在40歲(sui)以(yi)上。食(shi)管癌(ai)典型(xing)的癥(zheng)狀為(wei)進行(xing)性咽(yan)下(xia)困難，先(xian)是難咽(yan)幹(gan)的(de)食(shi)物，繼(ji)而(er)是(shi)半流(liu)質食(shi)物，最後水(shui)和(he)唾(tuo)液也(ye)不能(neng)咽(yan)下(xia)。成纖維細胞(bao)（Fibroblast）是(shi)疏松(song)結(jie)締(di)組(zu)織(zhi)的(de)主要(yao)細胞(bao)成分，由胚胎時期(qi)的(de)間(jian)充(chong)質細胞(bao)分化而(er)來。成纖維細胞(bao)較(jiao)大，輪廓(kuo)清(qing)楚(chu)，多(duo)為(wei)突起的(de)紡(fang)錘(chui)形(xing)或星(xing)形(xing)的扁(bian)平狀(zhuang)結構，其細胞(bao)核(he)呈規則(ze)的(de)卵圓(yuan)形(xing)，核仁(ren)大而(er)明(ming)顯。成纖維細胞(bao)功(gong)能(neng)活動(dong)旺盛(sheng)，細胞(bao)質嗜弱(ruo)堿性，具(ju)明(ming)顯的(de)蛋白質合(he)成和(he)分泌活動(dong)，在壹(yi)定(ding)條(tiao)件(jian)下(xia)，它(ta)可以(yi)實現跟纖維細胞(bao)的(de)互相(xiang)轉化；成纖維細胞(bao)對(dui)不同程(cheng)度(du)的(de)細(xi)胞(bao)變性、壞(huai)死(si)和(he)組織缺(que)損(sun)的(de)修(xiu)復有著(zhe)十(shi)分重要(yao)的作(zuo)用。剛(gang)分離的(de)表皮(pi)成纖維細胞(bao)呈(cheng)圓形(xing)、折光(guang)性良(liang)好，懸(xuan)浮(fu)於(yu)培養(yang)基中。30min細胞(bao)貼壁(bi)，其(qi)中部(bu)分開(kai)始伸(shen)出(chu)偽足(zu)，表現為(wei)小的(de)突起；6h後細(xi)胞(bao)基(ji)本(ben)貼壁(bi)wan全(quan)，伸(shen)展(zhan)成梭形(xing)，胞(bao)核(he)清晰，分布較(jiao)均(jun)勻(yun)，散在(zai)生長，不聚(ju)集成團；細(xi)胞(bao)生(sheng)長迅速(su)，5-7天即(ji)呈(cheng)融合(he)狀態(tai)，細胞(bao)排(pai)列(lie)緊密(mi)，有的(de)交叉(cha)重疊(die)生(sheng)長(chang)，平坦、胞(bao)體較(jiao)大(da)，細(xi)胞(bao)質透明(ming)，細胞(bao)核(he)較大，呈橢圓形(xing)，顏(yan)色淡(dan)。細胞(bao)融合(he)，並(bing)彼(bi)此(ci)連接(jie)成網(wang)狀；細(xi)胞(bao)呈(cheng)突起的(de)紡(fang)錘(chui)形(xing)或星(xing)形(xing)的扁(bian)平分布。
方(fang)法(fa)簡(jian)介：

公(gong)司實驗(yan)室(shi)分離的(de)人(ren)食(shi)管癌(ai)組織(zhi)源(yuan)成纖維采用yi蛋白酶(mei)-膠(jiao)原酶(mei)混(hun)合(he)酶消化(hua)後差(cha)速(su)貼壁(bi)制(zhi)備(bei)而(er)來，細胞(bao)總(zong)量(liang)約為(wei)5×10?cells/瓶(ping)。
質量(liang)檢(jian)測：

公(gong)司實驗(yan)室(shi)分離的(de)人(ren)食(shi)管癌(ai)組織(zhi)源(yuan)成纖維經Vimentin免疫熒(ying)光(guang)鑒定(ding)，純度(du)可達90%以(yi)上(shang)，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支(zhi)原體、細(xi)菌、酵(jiao)母(mu)和(he)真(zhen)菌等。

培(pei)養(yang)基(ji) 含(han)FBS、生(sheng)長(chang)添(tian)加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻(pin)率 每(mei)2-3天(tian)換液壹(yi)次

生(sheng)長(chang)特(te)性 貼壁(bi)

細(xi)胞(bao)形(xing)態(tai) 成纖維細胞(bao)樣(yang)

傳(chuan)代(dai)特(te)性 可傳(chuan)5代(dai)左右(you)；3代(dai)以(yi)內(nei)狀態(tai)好

消化(hua)液 0.25%yi蛋白酶(mei)

培(pei)養(yang)條(tiao)件(jian) 氣相(xiang)：空(kong)氣，95%；CO2，5%

準(zhun)備(bei)工作(zuo)

1. 實驗(yan)器(qi)材準備(bei)：準(zhun)備(bei)無(wu)菌的培養(yang)皿(min)、培(pei)養瓶(ping)、移(yi)液管、離心管、手(shou)術器(qi)械等，並(bing)進行(xing)高壓(ya)滅菌或其他(ta)合(he)適的消毒(du)處理(li)。

2. 試(shi)劑準(zhun)備(bei)：配(pei)制(zhi)或(huo)購(gou)買(mai)合(he)適的培(pei)養基(ji)、消化(hua)酶（如(ru)、膠(jiao)原酶(mei)等）、胎牛血清、雙抗(kang)等試(shi)劑，確保其(qi)無菌且在有效(xiao)期(qi)內(nei)。

3. 實驗(yan)動(dong)物或(huo)組(zu)織(zhi)來源準(zhun)備(bei)：根(gen)據實驗(yan)需求(qiu)，選(xuan)擇合(he)適的動(dong)物並(bing)進行(xing)相(xiang)應的麻醉或處(chu)死(si)，獲取所需組(zu)織；或(huo)從(cong)已(yi)有的(de)組織(zhi)樣(yang)本(ben)庫(ku)中(zhong)獲(huo)取組(zu)織。

取材與處(chu)理(li)

1. 取材：在無(wu)菌條件(jian)下(xia)，迅速(su)取出(chu)目標(biao)組(zu)織(zhi)，盡(jin)量(liang)減少對(dui)組織的損(sun)傷，並(bing)去除多余(yu)的脂肪(fang)、結締(di)組(zu)織(zhi)等非(fei)目的組織。

2. 清(qing)洗(xi)：將(jiang)取出(chu)的組(zu)織(zhi)用預冷的無(wu)菌PBS沖洗(xi)數(shu)次，以去除血液和(he)雜質。

3. 剪(jian)切(qie)：將(jiang)組織(zhi)剪(jian)成約1 - 2mm³的(de)小塊(kuai)，以(yi)便後續(xu)消化(hua)。

細(xi)胞(bao)分離

1. 消化(hua)：將(jiang)剪(jian)碎(sui)的組織(zhi)塊(kuai)放(fang)入含有適量(liang)消化(hua)酶的離心管中，在37℃恒溫(wen)搖(yao)床或培養箱(xiang)中消化(hua)壹(yi)段時間(jian)。期(qi)間(jian)可輕(qing)輕(qing)搖晃離心管，使消化(hua)更均(jun)勻(yun)。

2. 終(zhong)止消化(hua)：當組織(zhi)塊(kuai)大部(bu)分被消化(hua)成單細(xi)胞(bao)懸(xuan)液或小細(xi)胞(bao)團(tuan)時，加入含血清的(de)培養(yang)基終(zhong)止消化(hua)。

3. 過濾(lv)與離心：用細(xi)胞(bao)篩(shai)過濾(lv)細胞(bao)懸(xuan)液，去除未(wei)消化(hua)的組織(zhi)碎(sui)片，然後將(jiang)濾(lv)液以適當的(de)轉速(su)離心，收集細胞(bao)沈(chen)澱。

細(xi)胞(bao)觀察與檢(jian)測

1. 日(ri)常(chang)觀察：每(mei)天用倒(dao)置(zhi)顯(xian)微(wei)鏡(jing)觀察細(xi)胞(bao)的(de)形(xing)態(tai)、生長(chang)狀(zhuang)態(tai)、密(mi)度(du)等，記(ji)錄(lu)細(xi)胞(bao)的(de)變化(hua)情(qing)況(kuang)，如(ru)發現細胞(bao)汙(wu)染或異(yi)常(chang)，及(ji)時采取相(xiang)應措施。
2. 細胞(bao)計(ji)數(shu)與活力(li)檢(jian)測：在需要時，可采(cai)用臺(tai)盼藍染(ran)色等方(fang)法(fa)對(dui)細胞(bao)進行(xing)計(ji)數(shu)和(he)活力(li)檢(jian)測，以了解細胞(bao)的(de)生長情(qing)況(kuang)和(he)健(jian)康狀態(tai)。

壹(yi)、取材與分離

1. 快速(su)操(cao)作(zuo)

- 組(zu)織(zhi)取材後需(xu)立(li)即(ji)處(chu)理(li)，避(bi)免長時間(jian)暴(bao)露於(yu)室(shi)溫(wen)或(huo)非(fei)營(ying)養環境(jing)。

- 使(shi)用無(wu)菌 PBS 或生理(li)鹽水沖(chong)洗(xi)組織(zhi)，去除血液、雜質。

2. 消化(hua)酶選擇

- 根(gen)據組織類(lei)型(xing)選擇消化(hua)酶，避免過度(du)消化(hua)導致細胞(bao)損(sun)傷。

- 消化(hua)時間(jian)需(xu)嚴格控制（通(tong)常(chang) 10-30 分鐘(zhong)），可通(tong)過顯微(wei)鏡(jing)觀察細(xi)胞(bao)解(jie)離狀(zhuang)態(tai)。

二(er)、培養(yang)條件(jian)優(you)化(hua)

1. 培(pei)養(yang)基(ji)選擇

- 使(shi)用含(han)血(xue)清(qing)或(huo)特(te)定(ding)生(sheng)長(chang)因子(zi)的(de)培(pei)養(yang)基（如(ru) DMEM、RPMI 1640 等），部(bu)分細胞(bao)需(xu)添加胰(yi)島(dao)素(su)、EGF 等。

- 避(bi)免頻(pin)繁更換培養(yang)基品(pin)牌或(huo)批(pi)次，減少(shao)細(xi)胞(bao)適應壓(ya)力(li)。

2. 貼壁(bi)與傳(chuan)代(dai)

- 原代(dai)細(xi)胞(bao)貼壁(bi)能(neng)力(li)較弱(ruo)，可能(neng)需(xu)要(yao)包(bao)被(bei)培養皿(min)（如(ru)膠(jiao)原蛋白、多(duo)聚(ju)賴氨酸(suan)）。

- 傳(chuan)代(dai)時密(mi)度(du)建(jian)議控制在(zai) 70%-80%，過度(du)匯合(he)會(hui)導(dao)致接觸(chu)抑(yi)制(zhi)和(he)分化。

三(san)、汙(wu)染(ran)控制

1. 無(wu)菌操(cao)作(zuo)

- 全(quan)程(cheng)在(zai)超凈臺(tai)操(cao)作(zuo)，使(shi)用壹(yi)次性耗(hao)材，避免交叉(cha)汙染(ran)。

- 培(pei)養(yang)基(ji)中可添(tian)加(jia)雙抗(kang)，但長期(qi)使(shi)用可能(neng)影(ying)響細胞(bao)活性。

2. 支(zhi)原體檢(jian)測

- 定(ding)期(qi)檢(jian)測支原體汙(wu)染(ran)（如(ru) PCR 法(fa)），汙(wu)染(ran)後需(xu)及(ji)時丟棄細(xi)胞(bao)。

四(si)、狀(zhuang)態(tai)監控

1. 日(ri)常(chang)觀察

- 每(mei)天(tian)檢(jian)查細(xi)胞(bao)形(xing)態(tai)、密(mi)度(du)及(ji)培(pei)養基顏(yan)色，及(ji)時更換培養(yang)基（通(tong)常(chang)每(mei) 2-3 天(tian)換液壹(yi)次）。

- 異(yi)常(chang)形(xing)態(tai)（如(ru)細(xi)胞(bao)變圓(yuan)、碎片增(zeng)多(duo)）可能(neng)提(ti)示汙染(ran)或(huo)營(ying)養不足(zu)。

2. 傳(chuan)代(dai)與凍存

- 原代(dai)細(xi)胞(bao)分裂次數(shu)有限(xian)（壹(yi)般(ban) 5-10 代(dai)），需(xu)及(ji)時凍存早期(qi)代(dai)次細胞(bao)。

- 凍存液建(jian)議使用 DMSO+血(xue)清(qing)（或(huo)專(zhuan)用凍存培養(yang)基(ji)），梯度(du)降(jiang)溫(wen)後液氮保(bao)存。