【概要(yao)描(miao)述(shu)】人角(jiao)膜(mo)成(cheng)纖(xian)維細胞(bao)公(gong)司(si)正(zheng)在出(chu)售(shou)的(de)產(chan)品：Pr-HNV8菜青蟲(chong)卵(luan)巢(chao)細(xi)胞(bao)NRK (大鼠(shu)腎(shen)細(xi)胞(bao)) (種屬(shu)鑒定正(zheng)確(que))NRK-52E (大(da)鼠(shu)腎細胞(bao)) (種屬(shu)鑒定正(zheng)確(que))RBL-2H3 (大(da)鼠(shu)嗜堿(jian)性細胞(bao)白血(xue)病(bing)細(xi)胞(bao)) (種屬(shu)鑒定正(zheng)確(que))RH-35 (大(da)鼠(shu)肝癌(ai)細胞(bao)) (種屬(shu)鑒定正(zheng)確(que))RSC96 (大(da)鼠(shu)雪(xue)旺(wang)細(xi)胞(bao)) (種屬(shu)鑒定正(zheng)確(que))SHZ-88 (大(da)鼠(shu)乳腺癌(ai)細胞(bao)) (種屬(shu)鑒定正(zheng)確(que))Y3-Ag 1.2.3 (大(da)鼠(shu)骨髓瘤細(xi)胞(bao))

人角(jiao)膜(mo)成(cheng)纖(xian)維分離自眼(yan)角(jiao)膜(mo)組(zu)織；角(jiao)膜(mo)位(wei)於眼球(qiu)前(qian)壁的(de)壹層透(tou)明膜(mo)，約(yue)占(zhan)纖維膜(mo)的(de)前1/6，從後面(mian)看角(jiao)膜(mo)呈(cheng)正(zheng)圓形，從前面(mian)看為(wei)橫橢圓形。角(jiao)膜(mo)厚(hou)度(du)各(ge)部分不盡相(xiang)同(tong)，中央部最薄。角(jiao)膜(mo)有十(shi)分敏感(gan)的(de)神經末(mo)梢(shao)，如(ru)有外物接觸角(jiao)膜(mo)，眼(yan)瞼(jian)便(bian)會(hui)不由(you)自(zi)主(zhu)地(di)合上(shang)以(yi)保(bao)護眼(yan)睛(jing)。為(wei)了保(bao)持透(tou)明，角(jiao)膜(mo)並沒(mei)有血管(guan)，透(tou)過(guo)外界(jie)空(kong)氣、淚液(ye)及(ji)房水獲取(qu)養(yang)份及氧(yang)氣(qi)。角(jiao)膜(mo)分(fen)為(wei)五(wu)層(ceng)，由(you)前(qian)向後依次為(wei)：上(shang)皮細(xi)胞(bao)層、前(qian)彈(dan)力(li)層、基(ji)質(zhi)層(ceng)、後彈力層、內皮細(xi)胞(bao)層。成(cheng)纖(xian)維細胞(bao)（Fibroblast）是疏(shu)松(song)結締(di)組(zu)織的(de)主(zhu)要(yao)細胞(bao)成(cheng)分(fen)，由(you)胚(pei)胎(tai)時期(qi)的(de)間(jian)充(chong)質(zhi)細(xi)胞(bao)分化(hua)而(er)來。成(cheng)纖(xian)維細胞(bao)較大(da)，輪(lun)廓清楚(chu)，多為(wei)突(tu)起(qi)的(de)紡(fang)錘(chui)形或(huo)星(xing)形的(de)扁平(ping)狀結構，其細胞(bao)核呈(cheng)規(gui)則(ze)的(de)卵圓形，核仁大而(er)明顯。成(cheng)纖(xian)維細胞(bao)功能(neng)活動旺(wang)盛，細胞(bao)質嗜(shi)弱堿(jian)性，具(ju)明顯(xian)的(de)蛋白(bai)質合成(cheng)和(he)分(fen)泌活(huo)動(dong)，在壹定條件(jian)下，它可(ke)以(yi)實現跟纖(xian)維細胞(bao)的(de)互相(xiang)轉化(hua)；成(cheng)纖(xian)維細胞(bao)對不同(tong)程(cheng)度(du)的(de)細胞(bao)變(bian)性、壞(huai)死(si)和(he)組織(zhi)缺(que)損(sun)的(de)修復有著十(shi)分重(zhong)要(yao)的(de)作(zuo)用。剛分離的(de)角(jiao)膜(mo)成(cheng)纖(xian)維細胞(bao)呈圓形、折光性良(liang)好(hao)，懸(xuan)浮於培養(yang)基(ji)中(zhong)。30min細(xi)胞(bao)貼(tie)壁，其(qi)中(zhong)部分開始伸(shen)出(chu)偽足(zu)，表(biao)現為(wei)小(xiao)的(de)突起(qi)；6h後細胞(bao)基(ji)本貼(tie)壁wan全(quan)，伸(shen)展成(cheng)梭(suo)形，胞(bao)核清晰(xi)，分(fen)布較(jiao)均勻，散(san)在生(sheng)長(chang)，不聚集成(cheng)團；細(xi)胞(bao)生(sheng)長(chang)迅速，5-7天(tian)即呈融合狀(zhuang)態，細(xi)胞(bao)排列緊(jin)密，有的(de)交叉重(zhong)疊(die)生(sheng)長(chang)，平坦、胞(bao)體較(jiao)大(da)，細(xi)胞(bao)質透(tou)明，細胞(bao)核較(jiao)大(da)，呈(cheng)橢圓形，顏色(se)淡。細胞(bao)融合，並彼此連接成(cheng)網(wang)狀；細胞(bao)呈突(tu)起(qi)的(de)紡(fang)錘(chui)形或(huo)星(xing)形的(de)扁平(ping)分布。角(jiao)膜(mo)成(cheng)纖(xian)維細胞(bao)在生(sheng)理(li)條件(jian)下的(de)主(zhu)要(yao)功能(neng)包(bao)括：構造和(he)維持角(jiao)膜(mo)的(de)正(zheng)常形態，合成(cheng)和(he)釋(shi)放(fang)細胞(bao)外基(ji)質(zhi)以(yi)及組(zu)織(zhi)損(sun)傷後及時大量(liang)聚(ju)集修復損(sun)傷組織(zhi)。
方(fang)法(fa)簡介：

公(gong)司(si)實驗(yan)室(shi)分離(li)的(de)人角(jiao)膜(mo)成(cheng)纖(xian)維采用yi蛋白酶(mei)-膠(jiao)原酶(mei)混合消化(hua)法(fa)結合差(cha)速貼(tie)壁法(fa)制(zhi)備而(er)來，細胞(bao)總量(liang)約(yue)為(wei)5×10?cells/瓶。
質量(liang)檢(jian)測：

公(gong)司(si)實驗(yan)室(shi)分離(li)的(de)人角(jiao)膜(mo)成(cheng)纖(xian)維經Vimentin免疫(yi)熒(ying)光(guang)鑒定，純度(du)可(ke)達(da)90%以(yi)上(shang)，且(qie)不含有HIV-1、HBV、HCV、支(zhi)原(yuan)體、細菌、酵母(mu)和真(zhen)菌等(deng)。

本公(gong)司(si)所有產(chan)品僅(jin)供(gong)科學實驗(yan)，不做其(qi)他科學實驗(yan)外的(de)使用！

培養(yang)基(ji) 含FBS、生(sheng)長(chang)添(tian)加(jia)劑(ji)、Penicillin、Streptomycin等(deng)

換(huan)液(ye)頻(pin)率 每2-3天(tian)換(huan)液(ye)壹次

生(sheng)長(chang)特(te)性 貼(tie)壁

細胞(bao)形態 成(cheng)纖(xian)維細胞(bao)樣

傳代特(te)性 可(ke)傳(chuan)5代左(zuo)右(you)；3代以(yi)內狀態

消化(hua)液(ye) 0.25%yi蛋白酶(mei)

培養(yang)條件(jian) 氣相(xiang)：空氣(qi)，95%；CO2，5%

準(zhun)備工作(zuo)

1. 實驗(yan)器(qi)材準(zhun)備：準(zhun)備無菌的(de)培養(yang)皿(min)、培養(yang)瓶、移(yi)液(ye)管(guan)、離(li)心管(guan)、手(shou)術器(qi)械等(deng)，並進(jin)行(xing)高壓(ya)滅菌或(huo)其(qi)他合適(shi)的(de)消毒(du)處理(li)。

2. 試(shi)劑準(zhun)備：配制或(huo)購(gou)買(mai)合適(shi)的(de)培養(yang)基(ji)、消化(hua)酶(mei)（如(ru)、膠(jiao)原酶(mei)等(deng)）、胎(tai)牛(niu)血(xue)清、雙抗等(deng)試(shi)劑，確(que)保(bao)其(qi)無(wu)菌且(qie)在有效期(qi)內。

3. 實驗(yan)動(dong)物或(huo)組(zu)織(zhi)來(lai)源(yuan)準(zhun)備：根據(ju)實驗(yan)需(xu)求(qiu)，選(xuan)擇(ze)合適(shi)的(de)動物並進(jin)行(xing)相(xiang)應的(de)麻醉(zui)或(huo)處死(si)，獲取(qu)所需組織(zhi)；或(huo)從(cong)已(yi)有的(de)組織(zhi)樣本庫中(zhong)獲取(qu)組(zu)織。

取(qu)材與處理(li)

1. 取(qu)材：在無菌條件(jian)下，迅速取(qu)出(chu)目標組織(zhi)，盡量(liang)減(jian)少(shao)對組(zu)織的(de)損(sun)傷，並去除多余的(de)脂肪(fang)、結締(di)組(zu)織等(deng)非(fei)目的(de)組織(zhi)。

2. 清洗：將(jiang)取(qu)出(chu)的(de)組織(zhi)用預冷(leng)的(de)無菌PBS沖洗數次，以(yi)去除(chu)血(xue)液(ye)和(he)雜質。

3. 剪切(qie)：將(jiang)組(zu)織(zhi)剪成(cheng)約(yue)1 - 2mm³的(de)小塊(kuai)，以(yi)便後續消化(hua)。

細胞(bao)分離(li)

1. 消化(hua)：將(jiang)剪碎(sui)的(de)組織(zhi)塊放入含(han)有適量(liang)消化(hua)酶(mei)的(de)離心管(guan)中(zhong)，在37℃恒溫搖床或(huo)培(pei)養(yang)箱中(zhong)消化(hua)壹段時間(jian)。期(qi)間(jian)可(ke)輕(qing)輕(qing)搖晃離(li)心管(guan)，使消化(hua)更(geng)均勻。

2. 終(zhong)止消化(hua)：當組織(zhi)塊(kuai)大部分被消化(hua)成(cheng)單(dan)細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)或(huo)小(xiao)細(xi)胞(bao)團時(shi)，加(jia)入含(han)血(xue)清的(de)培養(yang)基(ji)終(zhong)止消化(hua)。

3. 過(guo)濾(lv)與離心：用細胞(bao)篩過(guo)濾(lv)細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)，去(qu)除未(wei)消化(hua)的(de)組織(zhi)碎(sui)片，然(ran)後將(jiang)濾(lv)液(ye)以(yi)適當的(de)轉速(su)離心，收(shou)集細胞(bao)沈(chen)澱。

細胞(bao)觀(guan)察與檢(jian)測

1. 日常觀(guan)察：每天(tian)用倒(dao)置顯(xian)微鏡(jing)觀(guan)察細胞(bao)的(de)形態、生(sheng)長(chang)狀態、密度(du)等(deng)，記錄(lu)細(xi)胞(bao)的(de)變(bian)化(hua)情況(kuang)，如(ru)發(fa)現細胞(bao)汙染或(huo)異(yi)常，及時采取(qu)相(xiang)應措(cuo)施。
2. 細(xi)胞(bao)計數(shu)與活力(li)檢(jian)測：在需要時(shi)，可(ke)采用臺盼藍染色(se)等(deng)方(fang)法(fa)對(dui)細胞(bao)進(jin)行(xing)計(ji)數(shu)和活力檢(jian)測，以(yi)了解(jie)細胞(bao)的(de)生(sheng)長(chang)情況(kuang)和(he)健康(kang)狀(zhuang)態。

壹、取(qu)材與分離(li)

1. 快速操(cao)作(zuo)

- 組織取(qu)材後需立即處理(li)，避免(mian)長時間(jian)暴(bao)露(lu)於室(shi)溫或(huo)非(fei)營(ying)養(yang)環(huan)境。

- 使用無菌 PBS 或(huo)生(sheng)理(li)鹽(yan)水沖洗組織(zhi)，去(qu)除血液(ye)、雜質。

2. 消化(hua)酶(mei)選(xuan)擇(ze)

- 根據組(zu)織類型選(xuan)擇(ze)消化(hua)酶(mei)，避免(mian)過(guo)度(du)消化(hua)導(dao)致細(xi)胞(bao)損(sun)傷。

- 消化(hua)時(shi)間(jian)需(xu)嚴(yan)格控(kong)制(zhi)（通常 10-30 分鐘），可(ke)通過(guo)顯微鏡(jing)觀(guan)察細胞(bao)解(jie)離狀(zhuang)態。

二、培養(yang)條件(jian)優(you)化

1. 培養(yang)基(ji)選(xuan)擇(ze)

- 使用含血清或(huo)特(te)定生(sheng)長(chang)因(yin)子(zi)的(de)培養(yang)基(ji)（如(ru) DMEM、RPMI 1640 等(deng)），部分細胞(bao)需添(tian)加(jia)胰島(dao)素(su)、EGF 等(deng)。

- 避免(mian)頻繁更(geng)換(huan)培養(yang)基(ji)品牌(pai)或(huo)批(pi)次，減(jian)少(shao)細胞(bao)適應(ying)壓(ya)力(li)。

2. 貼(tie)壁與傳代

- 原代細(xi)胞(bao)貼(tie)壁能(neng)力較弱，可(ke)能(neng)需要包(bao)被培(pei)養(yang)皿(min)（如(ru)膠(jiao)原蛋白、多聚賴氨(an)酸(suan)）。

- 傳代時(shi)密度(du)建(jian)議(yi)控(kong)制(zhi)在 70%-80%，過(guo)度(du)匯合會(hui)導(dao)致接觸抑制和(he)分(fen)化(hua)。

三(san)、汙(wu)染控(kong)制(zhi)

1. 無菌操(cao)作(zuo)

- 全程(cheng)在超(chao)凈臺操(cao)作(zuo)，使用壹次性耗材，避免(mian)交叉汙染。

- 培養(yang)基(ji)中(zhong)可(ke)添(tian)加(jia)雙抗，但長(chang)期(qi)使用可(ke)能(neng)影響(xiang)細胞(bao)活性。

2. 支(zhi)原(yuan)體檢(jian)測

- 定期檢(jian)測支(zhi)原(yuan)體汙染（如(ru) PCR 法(fa)），汙(wu)染後需及時丟棄細(xi)胞(bao)。

四、狀態監(jian)控(kong)

1. 日常觀(guan)察

- 每天(tian)檢(jian)查(zha)細(xi)胞(bao)形態、密度(du)及(ji)培(pei)養(yang)基(ji)顏(yan)色(se)，及時(shi)更換(huan)培養(yang)基(ji)（通常每 2-3 天(tian)換(huan)液(ye)壹次）。

- 異(yi)常形態（如(ru)細(xi)胞(bao)變(bian)圓、碎(sui)片增多）可(ke)能(neng)提示汙(wu)染或(huo)營(ying)養(yang)不足。

2. 傳代與凍存

- 原代細(xi)胞(bao)分裂(lie)次數有限（壹般 5-10 代），需(xu)及(ji)時凍存早(zao)期(qi)代次細胞(bao)。

- 凍存液(ye)建(jian)議(yi)使用 DMSO+血清（或(huo)專(zhuan)用凍存培(pei)養(yang)基(ji)），梯度(du)降(jiang)溫(wen)後液(ye)氮(dan)保(bao)存。