【概(gai)要(yao)描(miao)述】CD34免(mian)疫(yi)組(zu)化(hua)檢(jian)測試劑(ji)盒(he) H Western免(mian)疫(yi)印(yin)跡(ji)(Western Blot)是(shi)將(jiang)蛋白(bai)質轉移到(dao)膜上(shang)，然後(hou)利用(yong)抗(kang)體進行(xing)檢(jian)測。

CD34免(mian)疫(yi)組(zu)化(hua)檢(jian)測試劑(ji)盒(he)    H     Western Blot技(ji)術(shu):

壹(yi)、 原理

與(yu)Southern或(huo)Northern雜交(jiao)方(fang)法類似，但Western Blot采(cai)用(yong)的(de)是(shi)聚丙(bing)烯(xi)酰(xian)胺(an)凝膠(jiao)電(dian)泳，被(bei)檢(jian)測物是(shi)蛋(dan)白(bai)質，“探(tan)針(zhen)”是(shi)抗(kang)體，“顯(xian)色(se)”用(yong)標記的(de)二(er)抗(kang)。經過(guo)PAGE分(fen)離(li)的(de)蛋白(bai)質樣品，轉移到(dao)固(gu)相載體（例如(ru)硝(xiao)#纖(xian)維(wei)素(su)薄(bo)膜）上(shang)，固(gu)相載體以非共(gong)價鍵形式(shi)吸(xi)附(fu)蛋白(bai)質，且能(neng)保持(chi)電(dian)泳分(fen)離(li)的(de)多(duo)肽(tai)類型及(ji)其生物學活性不(bu)變(bian)。以固(gu)相載體上(shang)的(de)蛋白(bai)質或多(duo)肽(tai)作為(wei)抗原(yuan)，與對(dui)應的抗體起(qi)免(mian)疫(yi)反應，再與酶或同(tong)位素(su)標記的(de)第(di)二(er)抗(kang)體起(qi)反應，經過(guo)底(di)物顯色(se)或放射(she)自顯影(ying)以檢(jian)測電(dian)泳分(fen)離(li)的(de)特異(yi)性目(mu)的基(ji)因(yin)表達的蛋(dan)白(bai)成分。該技術(shu)也廣泛(fan)應用於檢(jian)測蛋白(bai)水平(ping)的表達。

二(er)、分(fen)類CD34免(mian)疫(yi)組(zu)化(hua)檢(jian)測試劑(ji)盒(he)    H  現(xian)常(chang)用的有底(di)物化學(xue)發(fa)光(guang)ECL和(he)底(di)物DAB呈(cheng)色(se)，體同(tong)水平(ping)和實(shi)驗(yan)條件(jian)的(de)是(shi)用(yong)*種方法，目(mu)前發(fa)表文(wen)章(zhang)通(tong)常(chang)是(shi)用(yong)底物化學(xue)發(fa)光(guang)ECL。只(zhi)要(yao)買(mai)現(xian)成的試劑(ji)盒(he)就行(xing)，操(cao)作也比較(jiao)簡(jian)單，原理(li)如(ru)下(xia)（二(er)抗(kang)用HRP標記）：反應底物為(wei)過(guo)氧(yang)化(hua)物+魯(lu)米(mi)諾(nuo)，如(ru)遇(yu)到HRP，即(ji)發(fa)光(guang)，可使膠(jiao)片曝(pu)光(guang)，就可洗(xi)出(chu)條帶。

三(san)、 主要(yao)試劑(ji)

、 丙(bing)烯(xi)酰(xian)胺(an)和N，N’-亞(ya)甲(jia)雙丙(bing)烯(xi)酰(xian)胺(an)，應以溫(wen)熱（以利(li)於溶(rong)解雙丙(bing)稀酰(xian)胺）的(de)去(qu)離(li)子水配制(zhi)含有(you)29%（w/v）丙(bing)稀酰(xian)胺和%（w/v）N，N’-亞(ya)甲(jia)雙丙(bing)烯(xi)酰(xian)胺(an)儲存液丙(bing)稀酰(xian)胺29g，N，N-亞(ya)甲(jia)叉(cha)雙丙(bing)稀酰(xian)胺g，加(jia)H2O至(zhi) 00ml。）儲(chu)於(yu)棕色(se)瓶(ping)，4℃避(bi)光(guang)保存。嚴(yan)格核(he)實(shi)PH不(bu)得超過(guo)7.0，因(yin)可以發(fa)生脫氨(an)基(ji)反應是(shi)光(guang)催化(hua)或(huo)堿(jian)催化的(de)。使用(yong)期(qi)不(bu)得超過(guo)兩個(ge)月，隔(ge)幾(ji)個(ge)月須(xu)重(zhong)新(xin)配制(zhi)。如(ru)有(you)沈澱(dian)，可以過(guo)濾(lv)。CD34免(mian)疫(yi)組(zu)化(hua)檢(jian)測試劑(ji)盒(he)    H  

2、 十(shi)二(er)烷(wan)基(ji)硫#鈉SDS溶(rong)液:0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去(qu)離(li)子水配制(zhi)，室溫(wen)保存。

3、 分(fen)離(li)膠(jiao)緩沖(chong)液:.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和(he)48mlmol/L HCl 混(hun)合，加(jia)水稀釋(shi)到(dao)00ml終(zhong)體積(ji)。過(guo)濾(lv)後(hou)40℃保(bao)存。

4、 濃(nong)縮膠(jiao)緩沖(chong)液:0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶(rong)於40mlH2O中(zhong)，用(yong)約(yue)48ml mol/L HCl調(tiao)至(zhi)pH6.8加(jia)水稀釋(shi)到(dao)00ml終(zhong)體積(ji)。過(guo)濾(lv)後(hou)40C保(bao)存。這兩種緩沖(chong)液必(bi)須(xu)使(shi)用(yong)Tris堿(jian)制(zhi)備(bei)，再用HCL調(tiao)節(jie)PH值(zhi)，而(er)不(bu)用(yong) Tris.CL。

5、 TEMED原(yuan)溶(rong)液N，N，N’N’四(si)甲(jia)基(ji)乙二(er)胺(an)催化(hua)過(guo)硫(liu)#銨(an)形成自由(you)基(ji)而(er)加速(su)兩種丙(bing)稀酰(xian)胺的聚合。PH太(tai)低時，聚合反應受到抑制(zhi)。0%（w/v）過(guo)硫(liu)#胺(an)溶(rong)液。提(ti)供兩種丙(bing)稀酰(xian)胺聚合所必須(xu)的(de)自由(you)基(ji)。去離(li)子水配制(zhi)數ml，臨(lin)用(yong)前配制(zhi).

6、 SDS- PAGE加(jia)樣(yang)緩沖(chong)液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖(chong)液8ml，甘油6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰(qiu)基(ji)乙醇(chun)3.2ml，0.05%溴(xiu)酚藍.6ml，H2O 32ml混(hun)勻(yun)備用(yong)。按(an):或(huo):2比(bi)例與(yu)蛋(dan)白(bai)質樣品混(hun)合，在(zai)沸(fei)水終(zhong)煮3min混(hun)勻(yun)後(hou)再上(shang)樣(yang)，壹般(ban)為(wei)20-25ul，總(zong)蛋(dan)白(bai)量(liang)00μg。

7、 Tris-甘氨(an)#電(dian)泳緩沖(chong)液:30.3gTris，88g甘氨(an)#，0gSDS，用(yong)蒸(zheng)餾(liu)水溶(rong)解至(zhi)000ml，得0.25mol/L Tris-.92mol/L甘氨(an)#電(dian)極緩沖(chong)液。臨(lin)用前稀釋(shi)0倍(bei)。

8、 轉移緩沖(chong)液：配制(zhi)L轉移緩沖(chong)液，需(xu)稱取2.9g甘氨(an)#、5.8gTris堿(jian)、0.37g SDS，並(bing)加(jia)入(ru)200ml甲(jia)醇(chun)，加(jia)水至(zhi)總(zong)量(liang)L。

9、 麗(li)春紅(hong)染(ran)液儲(chu)存液：麗(li)春紅(hong)S 2g 三(san)#乙(yi)#30g 磺(huang)基(ji)水楊(yang)# 30g 加(jia)水至(zhi)00ml 用(yong)時上(shang)述(shu)儲存液稀釋(shi)0倍(bei)即(ji)成麗春紅(hong)S使(shi)用(yong)液。使(shi)用後(hou)應予以廢(fei)棄。

0、 脫脂奶粉5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊(die)氮鈉（有(you)毒(du)，戴(dai)手(shou)套操作），溶(rong)於磷(lin)#緩沖(chong)鹽(yan)溶(rong)液（PBS）。

2、 Tris緩沖(chong)鹽(yan)溶(rong)液（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠(shu)抗人(ren)-MMP-9（6）鼠(shu)抗人(ren)-TIMP-。

4、 過(guo)氧(yang)化(hua)物酶標記的(de)第(di)二(er)抗(kang)體。

5、 NBT（溶(rong)於70%二(er)甲(jia)基(ji)甲酰胺，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶(rong)於00%二(er)甲(jia)基(ji)甲酰胺，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。（可以參(can)看(kan)分(fen)子克隆）