【概(gai)要(yao)描(miao)述(shu)】豬(zhu)心臟瓣膜(mo)內(nei)皮(pi)細(xi)胞(bao)的相關產(chan)品：LUVA人(ren)肥大細(xi)胞(bao)大鼠原(yuan)代(dai)角(jiao)膜(mo)上(shang)皮(pi)細(xi)胞(bao)人(ren)原代(dai)子(zi)宮(gong)蛻(tui)膜(mo)基質細(xi)胞(bao)大鼠原(yuan)代(dai)肝(gan)成(cheng)纖(xian)維細(xi)胞(bao)小(xiao)鼠(shu)原(yuan)代(dai)肺(fei)大動(dong)脈(mai)外(wai)膜成(cheng)纖(xian)維細(xi)胞(bao)小(xiao)鼠(shu)原(yuan)代(dai)腎(shen)系(xi)膜成(cheng)纖(xian)維細(xi)胞(bao)人(ren)口(kou)腔黏(nian)膜成(cheng)纖(xian)維細(xi)胞(bao)小(xiao)鼠(shu)原(yuan)代(dai)乳(ru)腺(xian)上(shang)皮(pi)細(xi)胞(bao)大鼠原(yuan)代(dai)腎(shen)小(xiao)球(qiu)內(nei)皮(pi)細(xi)胞(bao)人(ren)原代(dai)陰(yin)道(dao)成(cheng)纖(xian)維細(xi)胞(bao)

豬心臟瓣膜(mo)內(nei)皮(pi)細(xi)胞(bao)

包被(bei)條件 PLL（0.1mg/ml），明膠(jiao)（0.1%）

培養(yang)基 含(han)FBS、生長添(tian)加(jia)劑(ji)、Penicillin、Streptomycin等

換液頻(pin)率(lv) 每2-3天(tian)換(huan)液(ye)壹(yi)次

生長特性(xing) 貼壁

細(xi)胞(bao)形(xing)態(tai) 內(nei)皮(pi)細(xi)胞(bao)樣(yang)

傳代(dai)特(te)性(xing) 可(ke)傳2-3代(dai)

消化(hua)液 0.25%yi蛋白酶

培養(yang)條件 氣相：空氣(qi)，95%；CO2，5%

豬心臟瓣膜(mo)內(nei)皮(pi)分(fen)離自心臟瓣膜(mo)組織；心臟是脊(ji)椎動(dong)物身體中(zhong)最重要的壹(yi)個器(qi)官，主(zhu)要(yao)功(gong)能是為血液流(liu)動(dong)提供壓力(li)，把血液運行(xing)至(zhi)身體各個部分(fen)。心臟由心肌構成(cheng)，左(zuo)心(xin)房(fang)、左(zuo)心室、右心(xin)房(fang)、右心(xin)室四個腔組成(cheng)。左(zuo)右心(xin)房(fang)之(zhi)間和左右心(xin)室之(zhi)間(jian)均由間隔(ge)隔(ge)開(kai)，故互不相(xiang)通，心(xin)房(fang)與(yu)心室之(zhi)間(jian)有(you)瓣膜(mo)（房(fang)室瓣），這些(xie)瓣膜(mo)使(shi)血液只(zhi)能由心房(fang)流(liu)入心室，而(er)不(bu)能倒流。心(xin)臟的作用(yong)是(shi)推動(dong)血液流(liu)動(dong)，向器(qi)官、組織提供充足(zu)的血流量(liang)，以供應(ying)氧和各種(zhong)營養(yang)物(wu)質(zhi)，並帶走代(dai)謝(xie)的終產(chan)物(wu)（如二(er)氧化(hua)碳、無(wu)機(ji)鹽、尿素(su)和尿酸(suan)等(deng)），使(shi)細(xi)胞(bao)維(wei)持(chi)正(zheng)常(chang)的代(dai)謝(xie)和功能。心臟瓣膜(mo)在心(xin)臟不停(ting)止的血液循環活動(dong)中(zhong)扮演(yan)的角(jiao)色(se)即普通(tong)又(you)關鍵(jian)：瓣膜(mo)相(xiang)當(dang)於門(men)衛(wei)，阻止血液回(hui)流於剛(gang)剛(gang)離(li)開(kai)的心室。在心(xin)房(fang)與(yu)心室之(zhi)間(jian)，在心(xin)室與(yu)離開(kai)心室的血管之(zhi)間，都(dou)有(you)瓣膜(mo)。血液流(liu)過(guo)後(hou)，瓣膜(mo)就(jiu)會(hui)合(he)上(shang)最常見(jian)的瓣膜(mo)問(wen)題(ti)是二(er)尖瓣脫(tuo)垂，“二尖瓣"這個(ge)詞(ci)源(yuan)自“主(zhu)教冠"，它是主(zhu)教戴(dai)的帽(mao)子，有(you)兩(liang)個尖。位於左(zuo)心(xin)房(fang)和左心室之(zhi)間(jian)的瓣膜(mo)不(bu)能正常閉合(he)。
方法(fa)簡介(jie)：

公司實驗(yan)室分(fen)離的豬心(xin)臟瓣膜(mo)內(nei)皮(pi)采(cai)用(yong)yi蛋白酶-膠原(yuan)酶聯合(he)消化(hua)法(fa)結(jie)合(he)差(cha)速(su)貼(tie)壁法(fa)、並通(tong)過(guo)內(nei)皮(pi)細(xi)胞(bao)專(zhuan)用(yong)培養(yang)基培養(yang)篩(shai)選(xuan)制(zhi)備而來，細(xi)胞(bao)總量(liang)約(yue)為(wei)5×10?cells/瓶(ping)。
質量(liang)檢測(ce)：

公司實驗(yan)室分(fen)離的豬心(xin)臟瓣膜(mo)內(nei)皮(pi)經(jing)CD31免疫(yi)熒光鑒(jian)定，純度可(ke)達90%以上(shang)，且(qie)不含(han)有(you)HIV-1、HBV、HCV、支原(yuan)體、細(xi)菌(jun)、酵(jiao)母(mu)和真(zhen)菌(jun)等(deng)。

壹(yi)、細(xi)胞(bao)培養(yang)

1取(qu)材 在無(wu)菌(jun)環境下(xia)從(cong)機(ji)體取(qu)出某種(zhong)組織細(xi)胞(bao)（視實驗(yan)目的而定(ding)），經(jing)過(guo)壹(yi)定的處理(li)（如消化(hua)分(fen)散細(xi)胞(bao)、分(fen)離等）後(hou)接入培養(yang)器(qi)血中(zhong)，這壹(yi)過(guo)程(cheng)稱為取(qu)材。如是(shi)細(xi)胞(bao)株的擴大培養(yang)則(ze)無(wu)取(qu)材這壹(yi)過(guo)程(cheng)。機(ji)體取(qu)出的組織細(xi)胞(bao)的培養(yang)稱為原(yuan)代(dai)培養(yang)。2培養(yang) 將(jiang)取(qu)得(de)的組織細(xi)胞(bao)接入培養(yang)瓶(ping)或(huo)培養(yang)板(ban)中(zhong)的過(guo)程(cheng)稱為培養(yang)。3凍(dong)存(cun)及(ji)復蘇（可(ke)參閱後(hou)面(mian)有(you)關章(zhang)節）為了(le)保存(cun)細(xi)胞(bao)，特(te)別(bie)是不(bu)易(yi)獲得(de)的突變型(xing)細(xi)胞(bao)或(huo)細(xi)胞(bao)株，要將(jiang)細(xi)胞(bao)凍(dong)存(cun)。凍(dong)存(cun)的溫(wen)度壹(yi)般用(yong)液(ye)氮的溫(wen)度－196℃，將(jiang)細(xi)胞(bao)收(shou)集(ji)至(zhi)凍(dong)存(cun)管中(zhong)加(jia)入含(han)保護劑(ji)（壹(yi)般為(wei)二(er)甲(jia)亞碸或(huo)甘(gan)油(you)）的培養(yang)基，以壹(yi)定的冷卻(que)速(su)度凍(dong)存(cun)，最終保存(cun)於液(ye)氮中(zhong)。在極(ji)低的溫(wen)度下，細(xi)胞(bao)保存(cun)的時(shi)間(jian)幾(ji)乎(hu)是(shi)無(wu)限(xian)的。復蘇壹(yi)般采(cai)用(yong)快融(rong)方(fang)法(fa)，即從(cong)液(ye)氮中(zhong)取(qu)出凍(dong)存(cun)管後(hou)，立即放入37℃水(shui)中(zhong)，使(shi)之(zhi)在壹(yi)分(fen)鐘內(nei)迅(xun)速(su)融(rong)解(jie)。然後(hou)將(jiang)細(xi)胞(bao)轉(zhuan)入培養(yang)器(qi)皿中(zhong)進(jin)行(xing)培養(yang)。

二、原代(dai)細(xi)胞(bao)分(fen)離

凡(fan)是(shi)來源(yuan)於胚胎、組織器(qi)官及(ji)外(wai)周血，經(jing)特(te)殊分(fen)離方法(fa)制備而來的原初(chu)培養(yang)的細(xi)胞(bao)稱之為(wei)原代(dai)細(xi)胞(bao)。1懸浮細(xi)胞(bao)的分(fen)離方法(fa)組織材料(liao)若來自(zi)血液、羊(yang)水(shui)、胸(xiong)水(shui)或(huo)腹水(shui)的懸液材料(liao)，的方法(fa)是采(cai)用(yong)1000r/min的低速(su)離(li)心10分(fen)鐘。經(jing)離(li)心(xin)後(hou)由(you)於各(ge)種(zhong)細(xi)胞(bao)的比重(zhong)不(bu)同可(ke)在分(fen)層(ceng)液中(zhong)形(xing)成(cheng)不(bu)同(tong)層(ceng)，這樣(yang)可(ke)根據需(xu)要收(shou)獲目的細(xi)胞(bao)。2實體組織材料(liao)的分(fen)離方法(fa)對(dui)於實體組織材料(liao)，由(you)於細(xi)胞(bao)間(jian)結(jie)合(he)緊密，為(wei)了(le)使(shi)組織中(zhong)的細(xi)胞(bao)充(chong)分(fen)分(fen)散，形(xing)成(cheng)細(xi)胞(bao)懸液，可(ke)采用(yong)機(ji)械(xie)分(fen)散法(fa)（物理(li)裂(lie)解）和消化(hua)分(fen)離法(fa)。

三、細(xi)胞(bao)增(zeng)殖(zhi)檢測(ce)技(ji)術

目前主(zhu)要(yao)有(you)兩(liang)種(zhong)用(yong)於檢測(ce)細(xi)胞(bao)增(zeng)殖(zhi)能力(li)的方法(fa)。壹(yi)種(zhong)是直接的方法(fa)，通過(guo)直接測定(ding)進(jin)行(xing)分(fen)裂(lie)

的細(xi)胞(bao)數來評(ping)價細(xi)胞(bao)的增殖(zhi)能力(li)。另壹(yi)種(zhong)是間(jian)接的方法(fa)，即細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)（cell viability）檢測(ce)方(fang)法(fa)，通過(guo)檢測(ce)樣(yang)品中(zhong)健康(kang)細(xi)胞(bao)的數目來評(ping)價細(xi)胞(bao)的增殖(zhi)能力(li)。顯(xian)然，細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)檢測(ce)法(fa)並不(bu)能最終證(zheng)明檢測(ce)樣(yang)品中(zhong)的細(xi)胞(bao)是(shi)否(fou)在增(zeng)殖(zhi)。如細(xi)胞(bao)在某壹(yi)培養(yang)條件下會(hui)自發(fa)啟(qi)動(dong)雕亡程序，但(dan)藥物的幹擾(rao)可(ke)抑制雕亡的發生(sheng)；這時(shi)若采用(yong)細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)檢測(ce)法(fa)，顯(xian)然可(ke)以區(qu)分(fen)兩(liang)種(zhong)條件下的細(xi)胞(bao)數量(liang)，但(dan)我(wo)們(men)並不(bu)能從(cong)藥物幹擾(rao)組細(xi)胞(bao)數大於對(dui)照(zhao)組的事實說(shuo)明藥物可(ke)促(cu)進(jin)細(xi)胞(bao)增(zeng)殖(zhi)的結(jie)論。所以最直接的證據(ju)應(ying)該(gai)采用(yong)方(fang)法(fa)壹(yi)。

取(qu)材：首先(xian)，用(yong)培養(yang)液(ye)濕(shi)潤(run)所取(qu)的組織材料(liao)，並用(yong)鋒(feng)利的眼科剪去除(chu)附(fu)在其(qi)上(shang)的脂(zhi)肪(fang)和結(jie)締(di)組織。接著(zhe)用(yong)平(ping)衡(heng)液(ye)（如PBS或(huo)Hanks液）漂洗，再用(yong)眼科彎(wan)剪將(jiang)組織塊(kuai)剪成(cheng)小(xiao)塊(kuai)。多(duo)次用(yong)PBS或(huo)Hanks液漂洗，直到液體清(qing)亮、無(wu)油(you)滴為止。

接種(zhong)：用(yong)濕(shi)潤(run)的吸管吸取(qu)切(qie)碎(sui)的組織塊(kuai)，輕(qing)輕(qing)吹(chui)到培養(yang)瓶(ping)皿中(zhong)，並按壹(yi)定間距(ju)均勻放在培養(yang)瓶(ping)底壁上(shang)。註(zhu)意(yi)不要過(guo)多(duo)，確保組織塊(kuai)切(qie)面(mian)貼(tie)在培養(yang)瓶(ping)底壁上(shang)。

培養(yang)：將(jiang)培養(yang)瓶(ping)翻(fan)轉，使(shi)瓶(ping)底朝上(shang)，在種(zhong)植了(le)組織塊(kuai)壹(yi)側(ce)的對(dui)側(ce)面(mian)加(jia)足(zu)培養(yang)液(ye)，避免組織塊(kuai)與(yu)培養(yang)液(ye)接觸，然後(hou)塞(sai)緊瓶塞(sai)。將(jiang)種(zhong)植了(le)組織塊(kuai)的壹(yi)側(ce)朝上(shang)，靜(jing)置(zhi)於37℃培養(yang)箱(xiang)中(zhong)。待組織塊(kuai)貼壁1到3小時(shi)後(hou)翻(fan)瓶，使(shi)貼(tie)壁的組織塊(kuai)浸沒(mei)在培養(yang)液(ye)中(zhong)，繼(ji)續靜(jing)置(zhi)。換液：每隔(ge)2到3天(tian)更(geng)換(huan)壹(yi)次培養(yang)液(ye)，或(huo)者根據培養(yang)瓶(ping)種(zhong)顏色(se)的變化(hua)確定(ding)換液時(shi)間(jian)。

壹(yi)、原代(dai)細(xi)胞(bao)計(ji)數

將(jiang)血球(qiu)計數板(ban)及(ji)蓋片用(yong)擦(ca)試幹凈，並將(jiang)蓋片蓋在計(ji)數板(ban)上(shang)。

將(jiang)細(xi)胞(bao)懸液吸出少許(xu)，滴加(jia)在蓋片邊緣(yuan)，使(shi)懸液充滿(man)蓋片和計數板(ban)之(zhi)間。

靜(jing)置(zhi)3分(fen)鐘。

鏡(jing)下(xia)觀察，計(ji)算(suan)計數板(ban)四大格細(xi)胞(bao)總數，壓(ya)線(xian)細(xi)胞(bao)只(zhi)計(ji)左(zuo)側(ce)和上(shang)方(fang)的。然後(hou)按下式計(ji)算(suan)：

細(xi)胞(bao)數/ml＝4大格細(xi)胞(bao)總數/ 4×10000

註(zhu)意(yi)：鏡(jing)下(xia)偶見(jian)由(you)兩(liang)個以上(shang)細(xi)胞(bao)組成(cheng)的細(xi)胞(bao)團(tuan)，應(ying)按單個細(xi)胞(bao)計(ji)算(suan)，若細(xi)胞(bao)團(tuan)占(zhan)10%以上(shang)，說(shuo)明分(fen)散不好(hao)，需(xu)重新(xin)制(zhi)備細(xi)胞(bao)懸液。

二、原代(dai)細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)

將(jiang)細(xi)胞(bao)懸液以0.5ml加(jia)入試管中(zhong)。

加(jia)入0.5ml 0.4%臺(tai)盼蘭染(ran)液(ye)，染(ran)色(se)2壹(yi)3分(fen)鐘。

吸取(qu)少許(xu)懸液塗於載(zai)玻(bo)片(pian)上(shang)，加(jia)上(shang)蓋片。

鏡(jing)下(xia)取(qu)幾(ji)個任(ren)意(yi)視野分(fen)別(bie)計死(si)細(xi)胞(bao)和活細(xi)胞(bao)數，計(ji)細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)。

死(si)細(xi)胞(bao)能被(bei)臺(tai)盼蘭染(ran)上(shang)色(se)，鏡(jing)下(xia)可(ke)見(jian)深(shen)蘭色(se)的細(xi)胞(bao)，活(huo)細(xi)胞(bao)不(bu)被(bei)染(ran)色(se)，鏡(jing)下(xia)呈(cheng)無(wu)色(se)透(tou)明狀(zhuang)。

活力(li)測定(ding)可(ke)以和細(xi)胞(bao)計(ji)數合(he)起來進(jin)行(xing)，但(dan)要(yao)考慮到染(ran)液(ye)對(dui)原(yuan)細(xi)胞(bao)懸液的加(jia)倍(bei)稀(xi)釋作用(yong)。