【概要(yao)描(miao)述(shu)】Cyclin D免疫(yi)組化(hua)檢(jian)測試劑(ji)盒(he) H Western免疫(yi)印跡(ji)(Western Blot)是將蛋白(bai)質轉移到膜上(shang)，然後利用(yong)抗(kang)體進(jin)行(xing)檢(jian)測(ce)。

Cyclin D免疫(yi)組化(hua)檢(jian)測試劑(ji)盒(he)    H    Western Blot技(ji)術(shu):

壹、 原理(li)

與Southern或(huo)Northern雜(za)交(jiao)方(fang)法(fa)類(lei)似，但Western Blot采用(yong)的(de)是聚丙(bing)烯酰(xian)胺凝膠(jiao)電(dian)泳(yong)，被(bei)檢測物(wu)是蛋白(bai)質，“探(tan)針(zhen)”是抗(kang)體，“顯色”用(yong)標記的(de)二抗(kang)。經(jing)過PAGE分離的(de)蛋白(bai)質樣(yang)品(pin)，轉移到固(gu)相(xiang)載體（例如(ru)硝(xiao)#纖(xian)維素(su)薄(bo)膜(mo)）上，固(gu)相(xiang)載體以非共(gong)價鍵(jian)形式吸(xi)附(fu)蛋白(bai)質，且能保持電泳(yong)分離的(de)多肽(tai)類(lei)型(xing)及其(qi)生(sheng)物(wu)學活(huo)性(xing)不變(bian)。以(yi)固(gu)相(xiang)載體上的(de)蛋白(bai)質或多肽作(zuo)為(wei)抗(kang)原，與對(dui)應(ying)的(de)抗(kang)體起(qi)免疫(yi)反應，再(zai)與酶或(huo)同(tong)位(wei)素(su)標記的(de)第(di)二抗(kang)體起(qi)反應，經(jing)過底物(wu)顯(xian)色或放(fang)射自(zi)顯(xian)影以(yi)檢(jian)測電(dian)泳(yong)分離的(de)特(te)異性(xing)目的(de)基(ji)因(yin)表(biao)達的(de)蛋白(bai)成(cheng)分。該技術也(ye)廣泛應用(yong)於(yu)檢測(ce)蛋白(bai)水(shui)平的(de)表(biao)達。

二(er)、分類(lei)Cyclin D免疫(yi)組化(hua)檢(jian)測試劑(ji)盒(he)    H    現常用(yong)的(de)有底(di)物(wu)化(hua)學發(fa)光(guang)ECL和(he)底(di)物(wu)DAB呈色，體同(tong)水(shui)平和實(shi)驗(yan)條件的(de)是用(yong)*種方(fang)法(fa)，目前發(fa)表(biao)文章(zhang)通(tong)常是用(yong)底物(wu)化(hua)學發(fa)光(guang)ECL。只要買(mai)現成的(de)試劑(ji)盒(he)就行(xing)，操(cao)作也(ye)比較簡(jian)單，原理如(ru)下(xia)（二(er)抗(kang)用(yong)HRP標記）：反應底(di)物(wu)為(wei)過氧(yang)化(hua)物(wu)+魯米(mi)諾(nuo)，如(ru)遇(yu)到HRP，即(ji)發(fa)光(guang)，可(ke)使(shi)膠(jiao)片曝(pu)光(guang)，就可(ke)洗出(chu)條帶(dai)。

三(san)、 主要試劑(ji)

、 丙(bing)烯酰(xian)胺和N，N’-亞(ya)甲雙丙(bing)烯酰(xian)胺，應以(yi)溫熱（以利於(yu)溶(rong)解雙丙(bing)稀(xi)酰(xian)胺）的(de)去(qu)離子水(shui)配制(zhi)含(han)有29%（w/v）丙(bing)稀(xi)酰(xian)胺和%（w/v）N，N’-亞(ya)甲雙丙(bing)烯酰(xian)胺儲存(cun)液(ye)丙(bing)稀(xi)酰(xian)胺29g，N，N-亞(ya)甲叉雙丙(bing)稀(xi)酰(xian)胺g，加(jia)H2O至 00ml。）儲(chu)於(yu)棕(zong)色瓶(ping)，4℃避(bi)光(guang)保存。嚴(yan)格核(he)實(shi)PH不(bu)得超過7.0，因(yin)可(ke)以(yi)發(fa)生脫氨基(ji)反應是光(guang)催化(hua)或(huo)堿(jian)催(cui)化(hua)的(de)。使用(yong)期不(bu)得超過兩(liang)個月(yue)，隔幾個月(yue)須(xu)重(zhong)新配制(zhi)。如(ru)有(you)沈(chen)澱(dian)，可(ke)以(yi)過濾。 2、 十二(er)烷(wan)基(ji)硫(liu)#鈉(na)SDS溶(rong)液(ye):0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去(qu)離子水(shui)配制(zhi)，室溫保存。

Cyclin D免疫(yi)組化(hua)檢(jian)測試劑(ji)盒(he)    H    3、 分離膠(jiao)緩沖液(ye):.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和(he)48mlmol/L HCl 混合，加(jia)水(shui)稀(xi)釋(shi)到00ml終(zhong)體積(ji)。過濾後40℃保存。

4、 濃(nong)縮膠(jiao)緩沖液(ye):0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶(rong)於(yu)40mlH2O中(zhong)，用(yong)約48ml mol/L HCl調(tiao)至pH6.8加(jia)水(shui)稀(xi)釋(shi)到00ml終(zhong)體積(ji)。過濾後40C保存。這兩(liang)種(zhong)緩沖液(ye)必(bi)須(xu)使(shi)用(yong)Tris堿(jian)制(zhi)備，再用(yong)HCL調節(jie)PH值，而(er)不(bu)用(yong) Tris.CL。

5、 TEMED原(yuan)溶(rong)液(ye)N，N，N’N’四(si)甲基(ji)乙(yi)二胺催化(hua)過硫(liu)#銨(an)形成自(zi)由(you)基(ji)而(er)加(jia)速兩(liang)種(zhong)丙(bing)稀(xi)酰(xian)胺的(de)聚合。PH太低(di)時，聚合反應受到抑制(zhi)。0%（w/v）過硫(liu)#胺溶(rong)液(ye)。提(ti)供兩(liang)種(zhong)丙(bing)稀(xi)酰(xian)胺聚合所必(bi)須(xu)的(de)自由(you)基(ji)。去(qu)離子水(shui)配制(zhi)數(shu)ml，臨(lin)用(yong)前配制(zhi).

6、 SDS- PAGE加(jia)樣(yang)緩沖液(ye):pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖液(ye)8ml，甘(gan)油6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰基(ji)乙(yi)醇3.2ml，0.05%溴酚藍(lan).6ml，H2O 32ml混(hun)勻備用(yong)。按:或(huo):2比例與蛋白(bai)質樣(yang)品(pin)混合，在沸水(shui)終煮(zhu)3min混(hun)勻後再(zai)上(shang)樣(yang)，壹(yi)般為(wei)20-25ul，總(zong)蛋白(bai)量(liang)00μg。

7、 Tris-甘氨(an)#電泳(yong)緩沖液(ye):30.3gTris，88g甘氨#，0gSDS，用(yong)蒸餾(liu)水(shui)溶(rong)解至000ml，得0.25mol/L Tris-.92mol/L甘氨#電極緩沖液(ye)。臨(lin)用(yong)前稀(xi)釋(shi)0倍。

8、 轉移緩沖液(ye)：配制(zhi)L轉移緩沖液(ye)，需(xu)稱(cheng)取2.9g甘氨(an)#、5.8gTris堿(jian)、0.37g SDS，並(bing)加(jia)入(ru)200ml甲醇(chun)，加(jia)水(shui)至總(zong)量(liang)L。

9、 麗春紅(hong)染液(ye)儲(chu)存(cun)液(ye)：麗春紅(hong)S 2g 三(san)#乙(yi)#30g 磺(huang)基(ji)水(shui)楊(yang)# 30g 加(jia)水(shui)至00ml 用(yong)時上(shang)述儲(chu)存液(ye)稀(xi)釋(shi)0倍即(ji)成麗春紅(hong)S使(shi)用(yong)液(ye)。使(shi)用(yong)後應(ying)予以(yi)廢棄。

0、 脫脂(zhi)奶(nai)粉5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊(die)氮鈉(na)（有(you)毒，戴手套操(cao)作），溶(rong)於(yu)磷(lin)#緩沖鹽溶(rong)液(ye)（PBS）。

2、 Tris緩沖鹽溶(rong)液(ye)（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠(shu)抗(kang)人(ren)-MMP-9（6）鼠(shu)抗(kang)人(ren)-TIMP-。

4、 過氧(yang)化(hua)物(wu)酶標記的(de)第(di)二抗(kang)體。

5、 NBT（溶(rong)於(yu)70%二(er)甲(jia)基(ji)甲(jia)酰(xian)胺，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶(rong)於(yu)00%二(er)甲(jia)基(ji)甲(jia)酰(xian)胺，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。（可(ke)以(yi)參(can)看(kan)分子克(ke)隆）