【概要描(miao)述】MMP9免(mian)疫(yi)組化檢測試劑盒Western免(mian)疫(yi)印跡(Western Blot)是(shi)將(jiang)蛋白(bai)質轉移到(dao)膜上(shang)，然(ran)後利(li)用(yong)抗(kang)體進行檢測。

MMP9免(mian)疫(yi)組化檢測試劑盒Western Blot技術(shu):
壹(yi)、 原(yuan)理(li)
與Southern或(huo)Northern雜交方法類(lei)似(si)，但Western Blot采(cai)用的是(shi)聚(ju)丙烯酰胺(an)凝膠(jiao)電泳(yong)，被檢測物是(shi)蛋白(bai)質，“探針”是(shi)抗(kang)體，“顯(xian)色”用(yong)標記的二抗。經(jing)過PAGE分(fen)離(li)的蛋白(bai)質樣(yang)品(pin)，轉移到(dao)固(gu)相(xiang)載體（例如硝(xiao)#纖維素薄(bo)膜(mo)）上(shang)，固(gu)相(xiang)載體以非(fei)共價鍵形(xing)式吸(xi)附(fu)蛋白(bai)質，且(qie)能(neng)保持(chi)電泳(yong)分(fen)離(li)的多肽類(lei)型及(ji)其生物學(xue)活(huo)性不變(bian)。以(yi)固(gu)相(xiang)載體上的蛋白(bai)質或(huo)多肽作為(wei)抗(kang)原(yuan)，與(yu)對應(ying)的抗(kang)體起(qi)免(mian)疫(yi)反(fan)應，再(zai)與(yu)酶(mei)或(huo)同(tong)位(wei)素標記的第二抗體起(qi)反應，經(jing)過底物顯(xian)色或(huo)放射(she)自顯(xian)影(ying)以(yi)檢測電泳分(fen)離(li)的特(te)異性目(mu)的(de)基(ji)因(yin)表達(da)的蛋白(bai)成(cheng)分(fen)。該(gai)技術(shu)也(ye)廣(guang)泛(fan)應(ying)用於(yu)檢測蛋白(bai)水(shui)平(ping)的表達(da)。
二、分(fen)類(lei)MMP9免(mian)疫(yi)組化檢測試劑盒現常用的(de)有(you)底物化(hua)學(xue)發(fa)光ECL和底物DAB呈色，體同(tong)水(shui)平(ping)和實驗條(tiao)件的(de)是(shi)用(yong)*種(zhong)方法，目(mu)前(qian)發(fa)表文章通常(chang)是(shi)用(yong)底物化(hua)學(xue)發(fa)光ECL。只(zhi)要買現(xian)成(cheng)的試(shi)劑(ji)盒就(jiu)行，操(cao)作也(ye)比較簡單(dan)，原(yuan)理(li)如下(xia)（二抗(kang)用HRP標記）：反應底物為(wei)過(guo)氧化(hua)物(wu)+魯米(mi)諾，如遇(yu)到(dao)HRP，即(ji)發(fa)光，可使膠(jiao)片曝(pu)光，就(jiu)可洗出(chu)條(tiao)帶。
三(san)、主要試(shi)劑(ji)
、 丙烯酰胺(an)和N，N’-亞(ya)甲(jia)雙(shuang)丙烯酰胺(an)，應(ying)以溫(wen)熱（以利(li)於(yu)溶解(jie)雙(shuang)丙稀(xi)酰(xian)胺）的去(qu)離(li)子水(shui)配制含(han)有(you)29%（w/v）丙稀(xi)酰(xian)胺和%（w/v）N，N’-亞(ya)甲(jia)雙(shuang)丙烯酰胺(an)儲(chu)存(cun)液丙稀(xi)酰(xian)胺29g，N，N-亞(ya)甲(jia)叉(cha)雙(shuang)丙稀(xi)酰(xian)胺g，加(jia)H2O至(zhi) 00ml。）儲(chu)於(yu)棕色(se)瓶(ping)，4℃避(bi)光保存。嚴(yan)格核實PH不得(de)超(chao)過(guo)7.0，因(yin)可以發(fa)生脫(tuo)氨(an)基(ji)反應是(shi)光(guang)催化或(huo)堿催(cui)化的(de)。使(shi)用期(qi)不得(de)超(chao)過(guo)兩個月(yue)，隔(ge)幾個月(yue)須重(zhong)新配制。如(ru)有(you)沈澱(dian)，可以過濾(lv)。
2、 十二(er)烷(wan)基硫(liu)#鈉(na)SDS溶(rong)液:0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去(qu)離(li)子水(shui)配制，室(shi)溫(wen)保存。
3、 分(fen)離(li)膠(jiao)緩沖(chong)液:.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和48mlmol/L HCl 混合(he)，加(jia)水(shui)稀(xi)釋(shi)到(dao)00ml終體積(ji)。過(guo)濾(lv)後(hou)40℃保存。
4、 濃(nong)縮膠(jiao)緩沖(chong)液:0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶(rong)於(yu)40mlH2O中，用(yong)約48ml mol/L HCl調至(zhi)pH6.8加(jia)水(shui)稀(xi)釋(shi)到(dao)00ml終體積(ji)。過(guo)濾(lv)後(hou)40C保存。這(zhe)兩種(zhong)緩沖液必須(xu)使(shi)用(yong)Tris堿制備，再(zai)用(yong)HCL調(tiao)節(jie)PH值，而(er)不用(yong) Tris.CL。
5、 TEMED原(yuan)溶(rong)液N，N，N’N’四(si)甲(jia)基(ji)乙二胺(an)催化過(guo)硫(liu)#銨形(xing)成(cheng)自由(you)基(ji)而(er)加(jia)速(su)兩(liang)種(zhong)丙稀(xi)酰(xian)胺的聚(ju)合(he)。PH太低時(shi)，聚(ju)合(he)反(fan)應受到(dao)抑制。0%（w/v）過(guo)硫(liu)#胺(an)溶(rong)液。提(ti)供(gong)兩種(zhong)丙稀(xi)酰(xian)胺聚(ju)合(he)所(suo)必須(xu)的(de)自(zi)由(you)基。去(qu)離(li)子水(shui)配制數(shu)ml，臨(lin)用(yong)前(qian)配制.
6、 SDS- PAGE加(jia)樣(yang)緩(huan)沖(chong)液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩(huan)沖液8ml，甘(gan)油6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰基(ji)乙醇3.2ml，0.05%溴(xiu)酚藍.6ml，H2O 32ml混(hun)勻備用。按:或(huo):2比例與蛋白(bai)質樣(yang)品(pin)混(hun)合(he)，在(zai)沸水(shui)終煮3min混勻(yun)後再(zai)上(shang)樣(yang)，壹(yi)般為(wei)20-25ul，總(zong)蛋白(bai)量(liang)00μg。
7、 Tris-甘氨(an)#電(dian)泳(yong)緩沖(chong)液:30.3gTris，88g甘(gan)氨#，0gSDS，用(yong)蒸(zheng)餾水(shui)溶(rong)解(jie)至(zhi)000ml，得0.25mol/L Tris-.92mol/L甘氨(an)#電(dian)極緩(huan)沖液。臨(lin)用前(qian)稀(xi)釋(shi)0倍。
8、 轉移緩沖(chong)液：配制L轉移緩沖(chong)液，需稱(cheng)取2.9g甘氨#、5.8gTris堿、0.37g SDS，並(bing)加(jia)入(ru)200ml甲(jia)醇，加(jia)水(shui)至(zhi)總量(liang)L。
9、 麗春(chun)紅(hong)染液儲(chu)存(cun)液：麗(li)春(chun)紅(hong)S 2g 三#乙#30g 磺(huang)基(ji)水(shui)楊(yang)# 30g 加(jia)水(shui)至(zhi)00ml 用時(shi)上(shang)述儲(chu)存(cun)液稀(xi)釋(shi)0倍即(ji)成(cheng)麗春(chun)紅(hong)S使用(yong)液。使(shi)用後(hou)應予以廢(fei)棄。
0、 脫(tuo)脂(zhi)奶(nai)粉5%（w/v）。
、 NaN3 0.02% 疊(die)氮鈉(na)（有(you)毒(du)，戴手(shou)套(tao)操(cao)作），溶(rong)於(yu)磷#緩(huan)沖(chong)鹽溶液（PBS）。
2、 Tris緩(huan)沖鹽溶液（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。
3、 Tween20（5）鼠(shu)抗人(ren)-MMP-9（6）鼠(shu)抗(kang)人(ren)-TIMP-。
4、 過(guo)氧化(hua)物(wu)酶標記的第二抗體。
5、 NBT（溶於(yu)70%二甲(jia)基(ji)甲(jia)酰(xian)胺(an)，75mg/ml）。
6、 BCIP（溶於(yu)00%二甲(jia)基(ji)甲(jia)酰(xian)胺(an)，50mg/ml）。
7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。FGF2 免(mian)疫(yi)組化檢測試劑盒
8、 00mmol/L NaCl。
9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA