【概要描(miao)述】MRP免疫(yi)組(zu)化檢(jian)測(ce)試(shi)劑(ji)盒 Western免疫印跡(Western Blot)是將(jiang)蛋白質(zhi)轉(zhuan)移到(dao)膜(mo)上，然(ran)後(hou)利(li)用抗體(ti)進(jin)行檢(jian)測(ce)。

MRP免疫組化檢(jian)測(ce)試(shi)劑(ji)盒    Western Blot技術:

壹、 原(yuan)理

與Southern或(huo)Northern雜(za)交(jiao)方(fang)法(fa)類似(si)，但(dan)Western Blot采(cai)用的是聚丙烯酰(xian)胺(an)凝膠(jiao)電(dian)泳，被(bei)檢(jian)測(ce)物(wu)是蛋白質(zhi)，“探(tan)針(zhen)”是抗體(ti)，“顯色”用標(biao)記的(de)二(er)抗(kang)。經過PAGE分(fen)離(li)的(de)蛋(dan)白質(zhi)樣品，轉(zhuan)移到(dao)固相載體(ti)（例(li)如(ru)硝#纖(xian)維素(su)薄膜(mo)）上(shang)，固相載體(ti)以(yi)非共(gong)價(jia)鍵形(xing)式吸(xi)附蛋白質(zhi)，且能(neng)保(bao)持電(dian)泳分(fen)離(li)的(de)多(duo)肽類型及(ji)其(qi)生物學活(huo)性(xing)不(bu)變(bian)。以(yi)固相載體(ti)上(shang)的(de)蛋白質(zhi)或多(duo)肽(tai)作(zuo)為(wei)抗(kang)原(yuan)，與對(dui)應(ying)的(de)抗體(ti)起免(mian)疫反(fan)應，再(zai)與酶(mei)或同(tong)位素(su)標(biao)記的(de)第二(er)抗(kang)體(ti)起反(fan)應，經(jing)過底(di)物(wu)顯色或放射(she)自顯影以(yi)檢(jian)測(ce)電(dian)泳分(fen)離(li)的(de)特(te)異性(xing)目(mu)的(de)基(ji)因(yin)表(biao)達(da)的(de)蛋(dan)白成分(fen)。該技術也廣泛應(ying)用於檢(jian)測(ce)蛋(dan)白水平(ping)的表(biao)達(da)。

二(er)、分(fen)類MRP免(mian)疫(yi)組化檢(jian)測(ce)試(shi)劑(ji)盒    現常(chang)用的有底(di)物(wu)化學發(fa)光(guang)ECL和(he)底(di)物(wu)DAB呈(cheng)色(se)，體(ti)同(tong)水平(ping)和(he)實(shi)驗(yan)條件(jian)的是用*種方(fang)法，目(mu)前發(fa)表(biao)文章(zhang)通常是用底(di)物(wu)化學發(fa)光(guang)ECL。只(zhi)要(yao)買現成的試(shi)劑(ji)盒就(jiu)行，操作(zuo)也(ye)比(bi)較(jiao)簡單，原(yuan)理如(ru)下（二(er)抗(kang)用HRP標(biao)記）：反(fan)應底(di)物(wu)為(wei)過氧化物+魯(lu)米諾，如(ru)遇到(dao)HRP，即(ji)發(fa)光(guang)，可(ke)使膠(jiao)片(pian)曝(pu)光，就(jiu)可(ke)洗(xi)出(chu)條帶(dai)。

三(san)、 主(zhu)要(yao)試劑(ji)

、 丙烯酰(xian)胺(an)和(he)N，N’-亞(ya)甲(jia)雙丙烯酰(xian)胺(an)，應(ying)以(yi)溫熱(re)（以(yi)利(li)於溶(rong)解雙丙稀酰(xian)胺(an)）的(de)去(qu)離(li)子水配制含(han)有(you)29%（w/v）丙稀酰(xian)胺(an)和(he)%（w/v）N，N’-亞(ya)甲(jia)雙丙烯酰(xian)胺(an)儲存(cun)液(ye)丙稀酰(xian)胺(an)29g，N，N-亞(ya)甲(jia)叉雙丙稀酰(xian)胺(an)g，加H2O至(zhi) 00ml。）儲於(yu)棕(zong)色瓶(ping)，4℃避(bi)光保(bao)存(cun)。嚴格核實(shi)PH不(bu)得超(chao)過7.0，因(yin)可(ke)以(yi)發(fa)生(sheng)脫氨基(ji)反(fan)應是光催(cui)化或堿(jian)催(cui)化的。使(shi)用期(qi)不得超(chao)過兩個(ge)月，隔(ge)幾個(ge)月須重新配制。如(ru)有沈澱(dian)，可(ke)以(yi)過濾。

2、 十(shi)二(er)烷基(ji)硫(liu)#鈉(na)SDS溶(rong)液(ye):0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去(qu)離(li)子水配制，室(shi)溫保(bao)存(cun)。

3、 分(fen)離(li)膠(jiao)緩(huan)沖液(ye):.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和(he)48mlmol/L HCl 混(hun)合(he)，加水稀釋到00ml終(zhong)體(ti)積(ji)。過濾後40℃保(bao)存(cun)。

4、 濃(nong)縮膠緩沖液(ye):0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶(rong)於(yu)40mlH2O中(zhong)，用約(yue)48ml mol/L HCl調至pH6.8加水稀釋到00ml終(zhong)體(ti)積(ji)。過濾後40C保(bao)存(cun)。這(zhe)兩(liang)種緩(huan)沖液(ye)必須使用Tris堿(jian)制(zhi)備(bei)，再(zai)用HCL調節PH值，而(er)不(bu)用 Tris.CL。

5、 TEMED原(yuan)溶液(ye)N，N，N’N’四(si)甲(jia)基(ji)乙二(er)胺(an)催化過硫#銨(an)形(xing)成自由(you)基而(er)加速(su)兩(liang)種丙稀酰(xian)胺(an)的(de)聚(ju)合(he)。PH太(tai)低(di)時，聚(ju)合(he)反(fan)應受(shou)到抑(yi)制。0%（w/v）過硫#胺(an)溶(rong)液(ye)。提(ti)供(gong)兩種丙稀酰(xian)胺(an)聚(ju)合(he)所必須的自由(you)基。去(qu)離(li)子水配制數ml，臨用前配制.   

6、 SDS- PAGE加樣緩(huan)沖液(ye):pH6.8 0.5mol/L Tris緩(huan)沖液(ye)8ml，甘(gan)油(you)6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰(qiu)基乙醇3.2ml，0.05%溴酚藍(lan).6ml，H2O 32ml混(hun)勻備(bei)用。按(an):或(huo):2比(bi)例(li)與蛋(dan)白質(zhi)樣品混(hun)合(he)，在(zai)沸水(shui)終(zhong)煮3min混(hun)勻後(hou)再(zai)上(shang)樣，壹(yi)般(ban)為(wei)20-25ul，總(zong)蛋(dan)白量(liang)00μg。

7、 Tris-甘(gan)氨#電(dian)泳緩沖液(ye):30.3gTris，88g甘(gan)氨#，0gSDS，用蒸餾(liu)水溶解至(zhi)000ml，得0.25mol/L Tris-.92mol/L甘(gan)氨#電(dian)極緩(huan)沖液(ye)。臨用前稀釋0倍(bei)。

8、 轉(zhuan)移緩(huan)沖液(ye)：配制L轉(zhuan)移緩(huan)沖液(ye)，需(xu)稱(cheng)取2.9g甘(gan)氨#、5.8gTris堿(jian)、0.37g SDS，並(bing)加入200ml甲(jia)醇，加水至總(zong)量(liang)L。

9、 麗春紅染(ran)液(ye)儲存(cun)液(ye)：麗春紅S 2g 三(san)#乙#30g 磺(huang)基(ji)水楊# 30g 加水至00ml 用時上(shang)述儲存(cun)液(ye)稀釋0倍(bei)即(ji)成麗春紅S使(shi)用液(ye)。使(shi)用後應予(yu)以(yi)廢棄(qi)。

0、 脫脂(zhi)奶(nai)粉(fen)5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊氮鈉(na)（有(you)毒(du)，戴手套操作(zuo)），溶(rong)於(yu)磷(lin)#緩(huan)沖鹽溶液(ye)（PBS）。

2、 Tris緩(huan)沖鹽溶液(ye)（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠(shu)抗(kang)人-MMP-9（6）鼠(shu)抗(kang)人-TIMP-。

4、 過氧化物酶(mei)標(biao)記的(de)第二(er)抗(kang)體(ti)。

5、 NBT（溶(rong)於(yu)70%二(er)甲(jia)基甲酰(xian)胺(an)，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶(rong)於(yu)00%二(er)甲(jia)基甲酰(xian)胺(an)，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。（可(ke)以(yi)參(can)看(kan)分(fen)子克隆）