【概要(yao)描(miao)述(shu)】PCNA 免(mian)疫組(zu)化檢測(ce)試劑(ji)盒(he) H,M,R,Rb Western免(mian)疫印跡(Western Blot)是(shi)將蛋白(bai)質(zhi)轉(zhuan)移(yi)到(dao)膜(mo)上(shang)，然後利用(yong)抗體進(jin)行(xing)檢測(ce)。

PCNA 免(mian)疫組(zu)化檢測(ce)試劑(ji)盒(he)     H,M,R,Rb Western Blot技術:

壹(yi)、 原理(li)

與(yu)Southern或Northern雜(za)交方法類似(si)，但(dan)Western Blot采(cai)用(yong)的(de)是(shi)聚丙烯酰胺(an)凝膠(jiao)電(dian)泳(yong)，被(bei)檢測(ce)物是(shi)蛋白(bai)質(zhi)，“探(tan)針(zhen)”是(shi)抗體，“顯色(se)”用(yong)標(biao)記(ji)的二抗。經(jing)過(guo)PAGE分(fen)離(li)的(de)蛋白(bai)質(zhi)樣品(pin)，轉移(yi)到(dao)固(gu)相載(zai)體（例如硝#纖(xian)維(wei)素(su)薄(bo)膜）上(shang)，固相載(zai)體以(yi)非(fei)共(gong)價(jia)鍵形(xing)式吸附(fu)蛋白(bai)質(zhi)，且能(neng)保持(chi)電(dian)泳(yong)分(fen)離(li)的(de)多(duo)肽(tai)類型(xing)及(ji)其(qi)生物(wu)學(xue)活性不變。以(yi)固相載(zai)體上(shang)的蛋白(bai)質(zhi)或多肽(tai)作(zuo)為(wei)抗原，與(yu)對應的(de)抗體起(qi)免(mian)疫反(fan)應，再(zai)與(yu)酶或同(tong)位素(su)標(biao)記(ji)的(de)第二(er)抗體起(qi)反(fan)應，經(jing)過(guo)底物(wu)顯色(se)或放射自顯影(ying)以檢測(ce)電泳(yong)分(fen)離(li)的(de)特(te)異(yi)性目的基(ji)因(yin)表達的蛋白(bai)成(cheng)分(fen)。該(gai)技術也(ye)廣(guang)泛應用(yong)於(yu)檢測(ce)蛋白(bai)水(shui)平(ping)的(de)表(biao)達。

二、分(fen)類(lei)PCNA 免(mian)疫組(zu)化檢測(ce)試劑(ji)盒(he)     H,M,R,Rb現(xian)常用(yong)的(de)有(you)底物(wu)化學(xue)發光ECL和(he)底物(wu)DAB呈(cheng)色(se)，體同(tong)水(shui)平(ping)和(he)實驗條(tiao)件的是(shi)用*種方法，目前發表文(wen)章通(tong)常是(shi)用底物(wu)化學(xue)發光ECL。只(zhi)要(yao)買(mai)現成(cheng)的試劑(ji)盒(he)就行，操(cao)作(zuo)也比(bi)較(jiao)簡(jian)單，原理(li)如(ru)下（二(er)抗用HRP標(biao)記(ji)）：反(fan)應底物(wu)為(wei)過氧化物(wu)+魯米(mi)諾，如遇(yu)到(dao)HRP，即(ji)發光，可(ke)使膠(jiao)片曝(pu)光，就可洗(xi)出(chu)條(tiao)帶(dai)。

三(san)、 主(zhu)要(yao)試劑(ji)

、 丙(bing)烯(xi)酰胺(an)和(he)N，N’-亞(ya)甲(jia)雙(shuang)丙(bing)烯(xi)酰胺(an)，應以(yi)溫(wen)熱（以(yi)利於(yu)溶(rong)解(jie)雙(shuang)丙(bing)稀(xi)酰胺(an)）的(de)去(qu)離(li)子水(shui)配制含(han)有29%（w/v）丙(bing)稀(xi)酰胺(an)和(he)%（w/v）N，N’-亞(ya)甲(jia)雙(shuang)丙(bing)烯(xi)酰胺(an)儲存(cun)液丙(bing)稀(xi)酰胺(an)29g，N，N-亞(ya)甲(jia)叉雙(shuang)丙(bing)稀(xi)酰胺(an)g，加H2O至 00ml。）儲於(yu)棕色(se)瓶(ping)，4℃避(bi)光保存(cun)。嚴(yan)格(ge)核(he)實PH不(bu)得超過(guo)7.0，因(yin)可以(yi)發生脫(tuo)氨基(ji)反(fan)應是(shi)光催化或堿催化的(de)。使用期(qi)不得超過(guo)兩個月(yue)，隔幾個月(yue)須(xu)重(zhong)新配制。如(ru)有沈(chen)澱，可以(yi)過(guo)濾。

2、 十(shi)二(er)烷基(ji)硫(liu)#鈉(na)SDS溶(rong)液(ye):0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去(qu)離(li)子(zi)水(shui)配制，室(shi)溫(wen)保存(cun)。

3、 分(fen)離(li)膠(jiao)緩(huan)沖液:.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和(he)48mlmol/L HCl 混合(he)，加水(shui)稀(xi)釋(shi)到(dao)00ml終(zhong)體積(ji)。過濾(lv)後40℃保存(cun)。PCNA 免(mian)疫組(zu)化檢測(ce)試劑(ji)盒(he)     H,M,R,Rb

4、 濃縮膠(jiao)緩(huan)沖液:0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶(rong)於(yu)40mlH2O中(zhong)，用(yong)約48ml mol/L HCl調(tiao)至pH6.8加水(shui)稀(xi)釋(shi)到(dao)00ml終(zhong)體積(ji)。過濾(lv)後40C保存(cun)。這(zhe)兩種(zhong)緩(huan)沖液必(bi)須(xu)使用Tris堿(jian)制備，再(zai)用HCL調(tiao)節(jie)PH值(zhi)，而(er)不(bu)用 Tris.CL。

5、 TEMED原溶(rong)液(ye)N，N，N’N’四(si)甲(jia)基(ji)乙(yi)二(er)胺(an)催化過(guo)硫(liu)#銨(an)形(xing)成(cheng)自(zi)由(you)基(ji)而(er)加速兩種(zhong)丙稀(xi)酰胺(an)的聚合(he)。PH太低(di)時(shi)，聚合(he)反應受(shou)到(dao)抑制。0%（w/v）過(guo)硫(liu)#胺(an)溶(rong)液(ye)。提供(gong)兩種(zhong)丙稀(xi)酰胺(an)聚合(he)所(suo)必(bi)須(xu)的(de)自(zi)由(you)基(ji)。去(qu)離(li)子(zi)水(shui)配制數(shu)ml，臨(lin)用(yong)前(qian)配制.

6、 SDS- PAGE加樣緩(huan)沖液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩(huan)沖液8ml，甘(gan)油(you)6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰(qiu)基(ji)乙(yi)醇3.2ml，0.05%溴酚藍.6ml，H2O 32ml混勻(yun)備用(yong)。按:或:2比(bi)例與(yu)蛋白(bai)質(zhi)樣品(pin)混合(he)，在(zai)沸水(shui)終(zhong)煮(zhu)3min混勻(yun)後(hou)再(zai)上(shang)樣，壹般(ban)為(wei)20-25ul，總(zong)蛋白(bai)量(liang)00μg。

7、 Tris-甘(gan)氨(an)#電(dian)泳(yong)緩(huan)沖液:30.3gTris，88g甘(gan)氨(an)#，0gSDS，用(yong)蒸(zheng)餾(liu)水(shui)溶(rong)解(jie)至000ml，得0.25mol/L Tris-.92mol/L甘(gan)氨(an)#電(dian)極(ji)緩(huan)沖液。臨(lin)用前(qian)稀(xi)釋(shi)0倍(bei)。

8、 轉(zhuan)移(yi)緩(huan)沖液：配制L轉(zhuan)移(yi)緩(huan)沖液，需(xu)稱取(qu)2.9g甘(gan)氨(an)#、5.8gTris堿(jian)、0.37g SDS，並(bing)加入(ru)200ml甲(jia)醇，加水(shui)至總(zong)量(liang)L。

9、 麗(li)春紅染液(ye)儲存(cun)液：麗(li)春紅S 2g 三(san)#乙(yi)#30g 磺(huang)基(ji)水(shui)楊# 30g 加水(shui)至00ml 用(yong)時(shi)上(shang)述(shu)儲存(cun)液稀(xi)釋(shi)0倍(bei)即成麗春紅S使用液。使用後應予(yu)以(yi)廢(fei)棄(qi)。

0、 脫(tuo)脂(zhi)奶粉5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊(die)氮(dan)鈉(na)（有(you)毒(du)，戴(dai)手(shou)套操作(zuo)），溶(rong)於(yu)磷(lin)#緩(huan)沖鹽溶(rong)液（PBS）。

2、 Tris緩(huan)沖鹽溶(rong)液（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠(shu)抗人-MMP-9（6）鼠(shu)抗人-TIMP-。

4、 過(guo)氧化物(wu)酶(mei)標記(ji)的(de)第二(er)抗體。

5、 NBT（溶(rong)於(yu)70%二(er)甲(jia)基(ji)甲(jia)酰胺(an)，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶(rong)於(yu)00%二(er)甲(jia)基(ji)甲(jia)酰胺(an)，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。（可(ke)以(yi)參(can)看分(fen)子(zi)克(ke)隆(long)）