【概要描(miao)述】P2 免(mian)疫(yi)組(zu)化(hua)檢測(ce)試(shi)劑盒(he) Western免(mian)疫(yi)印跡(Western Blot)是將(jiang)蛋(dan)白(bai)質轉移到(dao)膜(mo)上(shang)，然(ran)後(hou)利用(yong)抗體進(jin)行(xing)檢測(ce)。

P2 免(mian)疫(yi)組(zu)化(hua)檢測(ce)試(shi)劑盒(he)      Western Blot技術:

壹、 原(yuan)理

與(yu)Southern或Northern雜(za)交方法(fa)類(lei)似(si)，但Western Blot采用(yong)的是聚丙烯酰胺凝膠(jiao)電(dian)泳，被(bei)檢測(ce)物是蛋(dan)白(bai)質，“探(tan)針(zhen)”是抗體，“顯(xian)色”用(yong)標記(ji)的二抗(kang)。經(jing)過PAGE分離的蛋(dan)白(bai)質樣(yang)品(pin)，轉(zhuan)移(yi)到(dao)固相(xiang)載體（例(li)如硝#纖(xian)維素(su)薄(bo)膜(mo)）上(shang)，固(gu)相(xiang)載體以(yi)非共價(jia)鍵形(xing)式吸(xi)附(fu)蛋(dan)白(bai)質，且(qie)能保持(chi)電(dian)泳分離的多(duo)肽(tai)類(lei)型及(ji)其生(sheng)物學(xue)活性不(bu)變。以固(gu)相(xiang)載體上(shang)的(de)蛋(dan)白(bai)質或多肽(tai)作(zuo)為抗原(yuan)，與對(dui)應的(de)抗體起免(mian)疫(yi)反應，再(zai)與(yu)酶(mei)或同位素(su)標記(ji)的第(di)二抗(kang)體起反應，經(jing)過底物顯(xian)色或放(fang)射自顯(xian)影以(yi)檢測(ce)電(dian)泳分離的特(te)異(yi)性目(mu)的(de)基因(yin)表(biao)達(da)的(de)蛋(dan)白(bai)成分。該技術也廣泛應用(yong)於(yu)檢測(ce)蛋(dan)白(bai)水(shui)平(ping)的(de)表(biao)達(da)。

二、分類P2 免(mian)疫(yi)組(zu)化(hua)檢測(ce)試(shi)劑盒(he)    現常用(yong)的有(you)底物化(hua)學(xue)發(fa)光(guang)ECL和(he)底物DAB呈(cheng)色，體同水(shui)平(ping)和(he)實驗條(tiao)件(jian)的(de)是用(yong)*種方法(fa)，目(mu)前(qian)發(fa)表(biao)文章通常是用(yong)底物化(hua)學(xue)發(fa)光(guang)ECL。只(zhi)要買現成的(de)試(shi)劑盒(he)就行，操作(zuo)也比較(jiao)簡(jian)單(dan)，原(yuan)理如下（二抗(kang)用(yong)HRP標(biao)記(ji)）：反應底物為過氧(yang)化(hua)物+魯(lu)米(mi)諾(nuo)，如遇(yu)到(dao)HRP，即(ji)發(fa)光(guang)，可使(shi)膠(jiao)片(pian)曝(pu)光(guang)，就可(ke)洗(xi)出(chu)條(tiao)帶(dai)。

三(san)、 主(zhu)要試(shi)劑

、 丙(bing)烯酰胺和N，N’-亞(ya)甲(jia)雙(shuang)丙烯酰胺，應以溫(wen)熱（以(yi)利於(yu)溶(rong)解(jie)雙(shuang)丙稀(xi)酰胺）的(de)去(qu)離(li)子(zi)水(shui)配(pei)制含(han)有(you)29%（w/v）丙(bing)稀(xi)酰胺和%（w/v）N，N’-亞(ya)甲(jia)雙(shuang)丙烯酰胺儲(chu)存(cun)液(ye)丙(bing)稀(xi)酰胺29g，N，N-亞(ya)甲(jia)叉(cha)雙(shuang)丙稀(xi)酰胺g，加H2O至(zhi) 00ml。）儲(chu)於(yu)棕色瓶(ping)，4℃避光(guang)保存(cun)。嚴格核實PH不(bu)得超過7.0，因(yin)可(ke)以(yi)發(fa)生(sheng)脫(tuo)氨基反應是光(guang)催(cui)化(hua)或堿催(cui)化(hua)的(de)。使(shi)用(yong)期不(bu)得超過兩(liang)個(ge)月，隔(ge)幾個(ge)月須重新配(pei)制。如有(you)沈澱(dian)，可(ke)以(yi)過濾(lv)。     2、 十(shi)二烷(wan)基(ji)硫#鈉(na)SDS溶(rong)液(ye):0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去(qu)離(li)子(zi)水(shui)配(pei)制，室溫(wen)保存(cun)。

3、 分離膠(jiao)緩(huan)沖(chong)液(ye):.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和(he)48mlmol/L HCl 混(hun)合，加水(shui)稀(xi)釋(shi)到(dao)00ml終(zhong)體積(ji)。過濾(lv)後40℃保(bao)存(cun)。

4、 濃縮膠(jiao)緩(huan)沖(chong)液(ye):0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶(rong)於(yu)40mlH2O中(zhong)，用(yong)約(yue)48ml mol/L HCl調至pH6.8加水(shui)稀(xi)釋(shi)到(dao)00ml終(zhong)體積(ji)。過濾(lv)後40C保(bao)存(cun)。這兩種緩沖(chong)液(ye)必(bi)須使用(yong)Tris堿(jian)制備(bei)，再用(yong)HCL調節(jie)PH值，而(er)不(bu)用(yong) Tris.CL。

5、 TEMED原(yuan)溶(rong)液(ye)N，N，N’N’四甲(jia)基(ji)乙二胺(an)催(cui)化(hua)過硫#銨(an)形(xing)成(cheng)自由基(ji)而(er)加速兩種丙稀(xi)酰胺的聚合。PH太低時，聚合反應受(shou)到(dao)抑制。0%（w/v）過硫#胺(an)溶(rong)液(ye)。提(ti)供(gong)兩種丙稀(xi)酰胺聚合所必(bi)須的自由基(ji)。去(qu)離子水(shui)配(pei)制數ml，臨(lin)用(yong)前(qian)配(pei)制.

6、 SDS- PAGE加樣(yang)緩(huan)沖(chong)液(ye):pH6.8 0.5mol/L Tris緩(huan)沖(chong)液(ye)8ml，甘(gan)油6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰(qiu)基(ji)乙醇3.2ml，0.05%溴(xiu)酚藍.6ml，H2O 32ml混(hun)勻(yun)備(bei)用(yong)。按(an):或:2比例(li)與蛋(dan)白(bai)質樣(yang)品(pin)混(hun)合，在沸水(shui)終(zhong)煮(zhu)3min混(hun)勻(yun)後(hou)再(zai)上(shang)樣(yang)，壹(yi)般為20-25ul，總蛋(dan)白(bai)量00μg。

7、 Tris-甘(gan)氨(an)#電(dian)泳緩(huan)沖(chong)液(ye):30.3gTris，88g甘(gan)氨(an)#，0gSDS，用(yong)蒸餾(liu)水(shui)溶(rong)解(jie)至(zhi)000ml，得0.25mol/L Tris-.92mol/L甘(gan)氨(an)#電(dian)極(ji)緩(huan)沖(chong)液(ye)。臨(lin)用(yong)前(qian)稀(xi)釋(shi)0倍(bei)。

8、 轉(zhuan)移(yi)緩(huan)沖(chong)液(ye)：配(pei)制L轉(zhuan)移(yi)緩(huan)沖(chong)液(ye)，需(xu)稱(cheng)取2.9g甘(gan)氨(an)#、5.8gTris堿(jian)、0.37g SDS，並(bing)加入200ml甲(jia)醇(chun)，加水(shui)至(zhi)總量L。

9、 麗(li)春(chun)紅(hong)染(ran)液(ye)儲(chu)存(cun)液(ye)：麗(li)春(chun)紅(hong)S 2g 三(san)#乙#30g 磺(huang)基(ji)水(shui)楊(yang)# 30g 加水(shui)至(zhi)00ml 用(yong)時上述(shu)儲(chu)存(cun)液(ye)稀(xi)釋(shi)0倍(bei)即(ji)成麗(li)春(chun)紅(hong)S使(shi)用(yong)液(ye)。使(shi)用(yong)後應(ying)予(yu)以(yi)廢棄。

0、 脫(tuo)脂奶粉(fen)5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊(die)氮(dan)鈉(na)（有(you)毒，戴手(shou)套操(cao)作(zuo)），溶(rong)於(yu)磷(lin)#緩(huan)沖(chong)鹽(yan)溶(rong)液(ye)（PBS）。

2、 Tris緩(huan)沖(chong)鹽(yan)溶(rong)液(ye)（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠(shu)抗(kang)人(ren)-MMP-9（6）鼠(shu)抗(kang)人(ren)-TIMP-。

4、 過氧(yang)化(hua)物酶(mei)標記(ji)的第(di)二抗(kang)體。

5、 NBT（溶(rong)於(yu)70%二甲(jia)基(ji)甲酰胺，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶(rong)於(yu)00%二甲(jia)基(ji)甲酰胺，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。    做(zuo)線粒(li)體膜(mo)UCP2蛋(dan)白(bai)的Western Blot （以下簡寫成Western Blot），提(ti)取線粒(li)體後(hou)凍(dong)存(cun)（未(wei)加蛋(dan)白(bai)酶(mei)抑制劑），樣(yang)品(pin)不(bu)能反復(fu)凍(dong)融(rong);，加蛋(dan)白(bai)酶(mei)抑制劑。同時，建議檢查(zha)Western Blot過程(cheng)， 提(ti)高壹抗濃度(du)。對(dui)於(yu)加蛋(dan)白(bai)酶(mei)抑制劑來說，壹般加PMSF就可以了(le)，能多加幾中(zhong)種蛋(dan)白(bai)酶(mei)抑制劑。
同壹蛋(dan)白(bai)樣(yang)品(pin)能同時進行(xing)兩(liang)種因子的(de)Western Blot檢測(ce)，有(you)的甚(shen)至可(ke)以(yi)同時測(ce)幾十種樣(yang)品(pin)。
如果(guo)是膜(mo)蛋(dan)白(bai)和胞漿蛋(dan)白(bai)，所用(yong)的去(qu)垢(gou)劑就要溫(wen)和得多，這時加上NaF去抑制磷#化(hua)酶(mei)的活性。
樣(yang)品(pin)的(de)蛋(dan)白(bai)含(han)量很低(di)，每(mei)微升(sheng)不(bu)到(dao)微克(ke)，但(dan)是在轉膜(mo)時經(jing)常會發(fa)現只(zhi)有(you)壹部(bu)分蛋(dan)白(bai)轉到(dao)了膜(mo)上(shang)，就(jiu)是在轉膜(mo)後(hou)染(ran)膠(jiao)發(fa)現有(you)的孔(kong)所有(you)的蛋(dan)白(bai)條(tiao)帶(dai)都在，只(zhi)是顏色變淡了(le)，可以(yi)加大上樣(yang)量(liang)，轉(zhuan)移(yi)時可以(yi)用(yong)減(jian)少電(dian)流(liu)延(yan)長時間，多加5-0%甲醇。
想(xiang)分離的蛋(dan)白(bai)是分子量260kd的(de)，SDS-PAGE電(dian)泳的(de)分離膠(jiao)濃度(du)用(yong)6%，Stacking Gel 3.5%，但260kd的(de)蛋(dan)白(bai)不(bu)好(hao)做(zuo)
如果(guo)上(shang)樣(yang)量(liang)超載，可以(yi)濃縮樣(yang)品(pin)，也(ye)可(ke)以根(gen)據(ju)妳(ni)的(de)目(mu)標分子量透(tou)析(xi)掉壹(yi)部(bu)分小(xiao)分子蛋(dan)白(bai)。壹般地(di)，超載30%是不(bu)會有(you)問題(ti)的(de)。如果(guo)已(yi)經(jing)超了(le)不(bu)少了，而(er)且(qie)小(xiao)分子量的(de)也(ye)要，可以考慮(lv)加大膠(jiao)的(de)厚度，可以試(shi)試(shi).5mm的 comb。
蛋(dan)白(bai)變性後(hou)存(cun)放(fang)-80℃，壹(yi)兩(liang)年沒有(you)問題(ti)，zui關(guan)鍵兩條(tiao)：不(bu)要被(bei)蛋(dan)白(bai)酶(mei)水(shui)解(jie)掉(diao);不(bu)要被(bei)細(xi)菌消化(hua)掉(diao)（也(ye)是被(bei)酶(mei)水(shui)解(jie)了(le)）。
采用(yong)DAB顯(xian)色技術，二抗(kang)是化(hua)的(de)多(duo)克(ke)隆抗體，三(san)抗是親和素(su)體系(xi)，不(bu)能使用(yong)脫(tuo)脂奶粉(fen)，脫(tuo)脂奶粉(fen)會影響(xiang)親和素(su)的生(sheng)成，因(yin)為脫(tuo)脂奶粉(fen)中(zhong)含(han)，用(yong)BSA代替應該(gai)好(hao)壹(yi)點(dian).
Western Blot壹(yi)般上樣(yang)30-00微克(ke)不(bu)等(deng)，結果(guo)跟目的(de)蛋(dan)白(bai)的豐度、上(shang)樣(yang)量(liang)、壹(yi)二抗(kang)的(de)量和(he)撫(fu)育(yu)時間都有(you)關系(xi)，也(ye)與(yu)顯(xian)色時間長短(duan)有(you)關。開(kai)始(shi)摸條(tiao)件(jian)時，為了拿到(dao)陽性結果(guo)，各(ge)個(ge)步(bu)驟(zhou)都可以量多(duo)壹(yi)點(dian)時間長壹(yi)點，當(dang)然(ran)背(bei)景(jing)也就(jiu)出(chu)來了。要拿到(dao)好(hao)的(de)結果(guo)，如果(guo)抗(kang)體好(hao)的(de)話比較(jiao)容(rong)易，抗體不(bu)好(hao)的(de)話就需(xu)要反復(fu)地(di)試(shi)了，當(dang)然(ran)有(you)的不(bu)適(shi)合Western Blot的怎樣(yang)做(zuo)也(ye)不(bu)行(xing)。所以(yi)拿(na)到(dao)好(hao)的(de)結果(guo)不(bu)容(rong)易。