【概要(yao)描述(shu)】30%單(dan)/雙丙(bing)烯酰胺(an)預制膠(jiao)溶(rong)液（9:）
)Western Blot)是(shi)將(jiang)蛋(dan)白(bai)質轉(zhuan)移(yi)到膜(mo)上(shang)，然(ran)後利用(yong)抗體(ti)進行檢(jian)測(ce)。

30%單(dan)/雙丙(bing)烯酰胺(an)預制膠(jiao)溶(rong)液（9:） 00ml500ml 



  Western Blot技術(shu):

壹(yi)、 原(yuan)理(li)

與(yu)Southern或Northern雜(za)交方(fang)法類似，但Western Blot采(cai)用(yong)的(de)是(shi)聚丙(bing)烯酰胺(an)凝膠電泳(yong)，被檢(jian)測(ce)物(wu)是(shi)蛋(dan)白(bai)質，“探針”是(shi)抗體(ti)，“顯色(se)”用(yong)標(biao)記(ji)的(de)二(er)抗。經過PAGE分(fen)離的(de)蛋(dan)白(bai)質樣(yang)品(pin)，轉(zhuan)移(yi)到固(gu)相(xiang)載體(ti)（例如硝(xiao)#纖(xian)維素薄膜）上(shang)，固(gu)相(xiang)載體(ti)以非(fei)共(gong)價鍵(jian)形(xing)式(shi)吸(xi)附(fu)蛋白(bai)質，且(qie)能(neng)保(bao)持(chi)電泳(yong)分(fen)離的(de)多(duo)肽類型及其生(sheng)物(wu)學活性不(bu)變(bian)。以(yi)固(gu)相(xiang)載體(ti)上(shang)的(de)蛋(dan)白(bai)質或(huo)多肽作為抗原(yuan)，與(yu)對(dui)應(ying)的(de)抗體(ti)起免疫反(fan)應，再與(yu)酶(mei)或同位(wei)素標(biao)記(ji)的(de)第(di)二(er)抗體(ti)起反(fan)應，經過底(di)物(wu)顯色(se)或(huo)放射自顯(xian)影(ying)以(yi)檢(jian)測(ce)電泳(yong)分(fen)離的(de)特(te)異性(xing)目(mu)的(de)基(ji)因表(biao)達(da)的(de)蛋(dan)白(bai)成(cheng)分(fen)。該技術(shu)也(ye)廣(guang)泛應(ying)用(yong)於(yu)檢(jian)測(ce)蛋(dan)白(bai)水平(ping)的(de)表(biao)達(da)。

二(er)、分(fen)類30%單(dan)/雙丙(bing)烯酰胺(an)預制膠(jiao)溶(rong)液（9:） 
現常(chang)用(yong)的(de)有(you)底(di)物(wu)化學發(fa)光ECL和底(di)物(wu)DAB呈色(se)，體(ti)同水平(ping)和(he)實驗(yan)條件(jian)的(de)是(shi)用(yong)*種(zhong)方(fang)法，目(mu)前發(fa)表(biao)文章(zhang)通(tong)常(chang)是(shi)用(yong)底(di)物(wu)化學發(fa)光ECL。只要買(mai)現成(cheng)的(de)試劑(ji)盒就(jiu)行(xing)，操(cao)作也(ye)比(bi)較簡單(dan)，原理(li)如(ru)下（二(er)抗用(yong)HRP標(biao)記(ji)）：反(fan)應底(di)物(wu)為過氧化物(wu)+魯(lu)米(mi)諾(nuo)，如(ru)遇到HRP，即發光(guang)，可(ke)使(shi)膠片(pian)曝(pu)光，就(jiu)可(ke)洗(xi)出條帶。

三(san)、 主要試劑(ji)

、 丙(bing)烯酰胺(an)和N，N’-亞(ya)甲雙丙(bing)烯酰胺(an)，應以溫熱（以利於(yu)溶(rong)解雙丙(bing)稀酰胺(an)）的(de)去離子水配制(zhi)含(han)有(you)29%（w/v）丙(bing)稀酰胺(an)和%（w/v）N，N’-亞(ya)甲雙丙(bing)烯酰胺(an)儲存(cun)液丙(bing)稀酰胺(an)29g，N，N-亞(ya)甲叉(cha)雙丙(bing)稀酰胺(an)g，加H2O至 00ml。）儲於棕(zong)色(se)瓶(ping)，4℃避光保(bao)存(cun)。嚴格核(he)實(shi)PH不(bu)得(de)超過7.0，因可(ke)以(yi)發生(sheng)脫氨基(ji)反(fan)應是(shi)光(guang)催化或堿(jian)催化的(de)。使(shi)用(yong)期不(bu)得(de)超過兩個月，隔(ge)幾(ji)個月須重新配制(zhi)。如(ru)有(you)沈(chen)澱，可(ke)以(yi)過濾。 
2、 十二(er)烷(wan)基(ji)硫#鈉SDS溶(rong)液:0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去離子水配制(zhi)，室(shi)溫(wen)保(bao)存(cun)。

3、 分(fen)離膠緩(huan)沖(chong)液:.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和48mlmol/L HCl 混合，加水稀釋到00ml終體(ti)積。過濾後40℃保存(cun)。

4、 濃縮(suo)膠(jiao)緩(huan)沖(chong)液:0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶(rong)於40mlH2O中，用(yong)約48ml mol/L HCl調至pH6.8加水稀釋到00ml終體(ti)積。過濾後40C保存(cun)。這兩種(zhong)緩(huan)沖(chong)液必須使(shi)用(yong)Tris堿制備(bei)，再用(yong)HCL調節PH值(zhi)，而不(bu)用(yong) Tris.CL。

5、 TEMED原溶(rong)液N，N，N’N’四(si)甲(jia)基(ji)乙(yi)二(er)胺(an)催化過硫#銨(an)形(xing)成(cheng)自由基(ji)而加速兩(liang)種(zhong)丙(bing)稀酰胺(an)的(de)聚合。PH太(tai)低(di)時(shi)，聚合反(fan)應受(shou)到抑(yi)制(zhi)。0%（w/v）過硫#胺(an)溶(rong)液。提(ti)供(gong)兩種丙(bing)稀酰胺(an)聚合所(suo)必(bi)須的(de)自由基(ji)。去離子水配制(zhi)數(shu)ml，臨用(yong)前(qian)配制(zhi).

6、 SDS- PAGE加樣(yang)緩沖(chong)液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖(chong)液8ml，甘油6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰基(ji)乙(yi)醇(chun)3.2ml，0.05%溴(xiu)酚藍.6ml，H2O 32ml混勻備(bei)用(yong)。按(an):或:2比例與(yu)蛋白(bai)質樣(yang)品(pin)混合，在(zai)沸水終(zhong)煮3min混勻後再上(shang)樣(yang)，壹般為20-25ul，總蛋白(bai)量(liang)00μg。

7、 Tris-甘氨#電泳(yong)緩沖(chong)液:30.3gTris，88g甘氨#，0gSDS，用(yong)蒸餾水溶(rong)解至000ml，得0.25mol/L Tris-.92mol/L甘氨#電極(ji)緩沖(chong)液。臨用(yong)前(qian)稀釋0倍。

8、 轉(zhuan)移(yi)緩(huan)沖(chong)液：配制(zhi)L轉(zhuan)移(yi)緩(huan)沖(chong)液，需稱(cheng)取2.9g甘氨#、5.8gTris堿、0.37g SDS，並加入(ru)200ml甲醇(chun)，加水至(zhi)總量(liang)L。

9、 麗(li)春紅染液儲存(cun)液：麗(li)春紅S 2g 三(san)#乙(yi)#30g 磺基(ji)水楊# 30g 加水至(zhi)00ml 用(yong)時(shi)上(shang)述(shu)儲存(cun)液稀釋0倍即成(cheng)麗(li)春紅S使(shi)用(yong)液。使(shi)用(yong)後應予以廢棄(qi)。

0、 脫脂奶粉(fen)5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊氮(dan)鈉（有(you)毒(du)，戴手套(tao)操(cao)作），溶(rong)於磷#緩沖(chong)鹽(yan)溶(rong)液（PBS）。

2、 Tris緩沖(chong)鹽(yan)溶(rong)液（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠抗人(ren)-MMP-9（6）鼠抗人(ren)-TIMP-。

4、 過氧化物(wu)酶標(biao)記(ji)的(de)第(di)二(er)抗體(ti)。

5、 NBT（溶(rong)於70%二(er)甲基(ji)甲酰胺(an)，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶(rong)於00%二(er)甲基(ji)甲酰胺(an)，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA 
做(zuo)線粒體(ti)膜UCP2蛋白(bai)的(de)Western Blot （以(yi)下簡寫(xie)成(cheng)Western Blot），提(ti)取線(xian)粒體(ti)後凍(dong)存(cun)（未加蛋(dan)白(bai)酶抑(yi)制(zhi)劑(ji)），樣(yang)品(pin)不(bu)能(neng)反(fan)復凍(dong)融;，加蛋(dan)白(bai)酶抑(yi)制(zhi)劑(ji)。同時(shi)，建(jian)議檢(jian)查Western Blot過程， 提(ti)高(gao)壹抗濃(nong)度(du)。對(dui)於(yu)加蛋(dan)白(bai)酶抑(yi)制(zhi)劑(ji)來說，壹(yi)般加PMSF就(jiu)可(ke)以(yi)了，能(neng)多(duo)加幾(ji)中種蛋白(bai)酶抑(yi)制(zhi)劑(ji)。
同壹蛋(dan)白(bai)樣(yang)品(pin)能(neng)同(tong)時(shi)進行(xing)兩種因子的(de)Western Blot檢(jian)測(ce)，有(you)的(de)甚(shen)至可(ke)以(yi)同時(shi)測幾(ji)十種樣(yang)品(pin)。
如果(guo)是(shi)膜(mo)蛋(dan)白(bai)和胞漿蛋(dan)白(bai)，所用(yong)的(de)去垢劑(ji)就(jiu)要(yao)溫(wen)和得(de)多，這(zhe)時(shi)加上(shang)NaF去抑(yi)制(zhi)磷#化酶的(de)活性。
樣(yang)品(pin)的(de)蛋(dan)白(bai)含量(liang)很低(di)，每(mei)微(wei)升(sheng)不(bu)到微(wei)克，但是(shi)在(zai)轉(zhuan)膜(mo)時(shi)經常會發現只有(you)壹(yi)部(bu)分(fen)蛋白(bai)轉(zhuan)到了(le)膜(mo)上(shang)，就(jiu)是(shi)在(zai)轉(zhuan)膜(mo)後染膠發現(xian)有(you)的(de)孔(kong)所有(you)的(de)蛋(dan)白(bai)條帶都在(zai)，只是(shi)顏(yan)色(se)變(bian)淡(dan)了(le)，可(ke)以(yi)加大上(shang)樣(yang)量(liang)，轉(zhuan)移(yi)時(shi)可(ke)以(yi)用(yong)減(jian)少電流(liu)延長(chang)時(shi)間，多(duo)加5-0%甲(jia)醇(chun)。
想(xiang)分(fen)離的(de)蛋(dan)白(bai)是(shi)分(fen)子量(liang)260kd的(de)，SDS-PAGE電泳(yong)的(de)分(fen)離膠濃(nong)度(du)用(yong)6%，Stacking Gel 3.5%，但260kd的(de)蛋(dan)白(bai)不(bu)好(hao)做(zuo)
如果(guo)上(shang)樣(yang)量(liang)超載(zai)，可(ke)以(yi)濃縮(suo)樣(yang)品(pin)，也(ye)可(ke)以(yi)根據(ju)妳的(de)目(mu)標(biao)分(fen)子量(liang)透析(xi)掉(diao)壹(yi)部(bu)分(fen)小分(fen)子蛋白(bai)。壹般地(di)，超(chao)載(zai)30%是(shi)不(bu)會有(you)問(wen)題的(de)。如(ru)果(guo)已經超了(le)不(bu)少了(le)，而且(qie)小(xiao)分(fen)子量(liang)的(de)也(ye)要(yao)，可(ke)以(yi)考(kao)慮加大膠的(de)厚(hou)度(du)，可(ke)以(yi)試試.5mm的(de) comb。
蛋(dan)白(bai)變(bian)性(xing)後存(cun)放-80℃，壹兩(liang)年沒有(you)問(wen)題，zui關(guan)鍵(jian)兩(liang)條：不(bu)要(yao)被蛋白(bai)酶水解掉(diao);不(bu)要(yao)被細菌消(xiao)化掉(diao)（也(ye)是(shi)被(bei)酶(mei)水解了）。
采(cai)用(yong)DAB顯(xian)色(se)技術(shu)，二(er)抗是(shi)化的(de)多(duo)克隆抗體(ti)，三(san)抗是(shi)親(qin)和(he)素(su)體(ti)系(xi)，不(bu)能(neng)使(shi)用(yong)脫脂奶粉(fen)，脫脂奶粉(fen)會影(ying)響(xiang)親和(he)素的(de)生(sheng)成(cheng)，因為脫脂奶粉(fen)中含，用(yong)BSA代(dai)替應(ying)該(gai)好(hao)壹點(dian).
Western Blot壹般上(shang)樣(yang)30-00微(wei)克不(bu)等(deng)，結(jie)果(guo)跟目(mu)的(de)蛋(dan)白(bai)的(de)豐度(du)、上(shang)樣(yang)量(liang)、壹二(er)抗的(de)量(liang)和撫(fu)育(yu)時(shi)間都有(you)關(guan)系(xi)，也(ye)與(yu)顯色(se)時(shi)間長(chang)短有(you)關(guan)。開始摸(mo)條件(jian)時(shi)，為了(le)拿(na)到陽(yang)性(xing)結果(guo)，各個步(bu)驟(zhou)都可(ke)以(yi)量(liang)多壹(yi)點時(shi)間長(chang)壹(yi)點，當然背(bei)景也(ye)就(jiu)出來了。要(yao)拿(na)到好(hao)的(de)結(jie)果(guo)，如果(guo)抗體(ti)好的(de)話(hua)比較容(rong)易，抗體(ti)不(bu)好(hao)的(de)話(hua)就(jiu)需(xu)要(yao)反(fan)復地(di)試了(le)，當然有(you)的(de)不(bu)適合Western Blot的(de)怎(zen)樣(yang)做(zuo)也(ye)不(bu)行(xing)。所以拿(na)到好(hao)的(de)結(jie)果(guo)不(bu)容(rong)易。